实时荧光定量PCR中两种引物的设计有什么要求?

参照以下real-time PCR引物设计原则：
1.最好位于编码区5’端的300-400bp区域内,可以用DNAman,Alignment 软件看看结果.
2.产物不能形成二级结构（*能小于58.61KJ/mol）.
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大.
4.G+C含量在40%~60%之间,45-55％最佳.
5.碱基要随机分布,尽量均匀.
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补.
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补.
8.引物5′端可以修饰.
9.3’端不要以A结尾,3′端不可修饰,而且要避开AT,GC rich的区域,避开T/C,A/G连续结构（2-3个）.
10.引物3′端要避开密码子的第3位.
11.引物整体设计*能分布5‘端大于3’端,且3‘端*能最好小于9KJ/mol.可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况.
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好,最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染,最好跨外显子接头区.
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源.
15.查看有无假基因的存在.假基因就是无功能的DNA序列,与需要扩增的目的片段长度相似.
16.TM值在55-63度之间.
17..引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源.