求蛋白分离纯化步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：
（一）材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性.所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎.常用的破碎组织细胞的方法有：
1.机械破碎法
这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎.常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等.
2.渗透破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎.
3.反复冻融法
生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破.这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法.
4.超声波法
使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎.
5.酶法
如用溶菌酶破坏微生物细胞等.
(二)蛋白质的抽提
通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来.抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定.如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等）,使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离.在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性.
（三）蛋白质粗制品的获得
选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来.比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离.常用的有下列几种方法：
1.等电点沉淀法
不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离.
2.盐析法
不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出.被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性.
3.有机溶剂沉淀法
中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低.能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质.此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出.由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度.
（四）样品的进一步分离纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质,须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品.常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等.
有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品.