基因测序原理是什么?

DNA测序的方法有很多种.目前最常见的是双脱氧终止法了.在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶.测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸(称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP),然后进行聚合反应.在第一个反应物中,ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链,由于其3位的羟基变成了氢,所以不能继续延伸.所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾,第四个反应的都以T结尾,电泳后就可以读出序列了.也许这样说你不一定明白.举一个例子,假如有一个DNA,互补序列是GATCCGAT,我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP,所以遇到G,T,C三个碱基时没什么问题,但遇到A时,掺入的可能是dATP或ddATP,比如已合成到G,下一个如果参与反应的是ddATP则终止,产生一个仅有2个核苷酸的序列:GA,否则继续延伸,可以产生序列GATCCG,又到了下一个A了.同样有两种情况,如果是ddATP掺入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT.
所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段:
GA,GATCCGA,
同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段:
GATC,GATCC,
在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段:
G,GATCCG
在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段:
GAT,GATCCGAT,
电泳时按分子量大小排列,A反应的片段长度为2,7; C反应的为4,5; G反应的为1,6; T反应的为3,8,四个反应的产物分别电泳,结果为
8 7 6 5 4 3 2 1
A | |
C | |
G | |
T | |
我们可以从右向左读,为GATCCGAT,至此,测序完成(上面这个图在百度知道中显示不正常,因为百度知道的网页用的是比例字体,你如果想看它,拷贝到记事本中,用等宽的字体来看).