怎么用可见紫外分光光度计测定样品?

不知道你旧测什么样的样品？不同的样品会有不的方法
用分光光度计测定质粒DNA的浓度
一、目的
熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。
二、原理
DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时，
dsDNA浓度约为50μg / ml
ssDNA浓度约为37μg / ml
RNA浓度约为40μg / ml
寡核苷酸浓度约为30μg / ml（youyu底物不同有差异）
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。
经验值：
纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6，表明有蛋白质、酚等污染）
纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）
若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。
三、材料、试剂及器具
1、 材料
提取的PUC19样品、PUC19标准样品
2、 试剂
灭菌重蒸水，TE缓冲液
3、 器皿
石英比色皿；UV-240紫外分光光度计
四、操作步骤
1、 UV-240紫外分光光度计开机预热10min.
2、 用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。
3、 设定狭缝后校零。
4、 将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记
录编号和稀释度。
5、 把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。
6、 设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。
7、 计算待测样品的浓度与纯度。
DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000
RNA样品的浓度（μg / μl）：OD260×稀释倍数×40/1000
752型紫外可见分光光度计
操作规程
目的：建立紫外可见分光光度计操作规程，确保其使用安全、正确。
范围：适用于752型紫外可见分光光度计。
操作规程：
1. 打开仪器开关，仪器使用前应预热30分钟。
2. 转动波长旋钮，观察波长显示窗，调整至需要的测量波长。
3. 根据测量波长，拨动光源切换杆，手动切换光源。200-339nm使用氘灯，切换杆拨至紫外区；340nm-1000nm使用卤钨灯，切换杆拨至可见区。
4. 调T零
在透视比（T）模式，将遮光体放入样品架，合上样品室盖，拉动样品架拉杆使其进入光路。按下“调0%”键，屏幕上显示“000.0”或“-000.0”时，调T零完成。
5.调100%T/ OA
先用参比（空白）溶液荡洗比色皿2-3次，将参比（空白）溶液倒入比色皿，溶液量约为比色皿高度的3/4，用擦镜纸将透光面擦拭干净，按一定的方向，将比色皿放入样品架。合上样品室盖，拉动样品架拉杆使其进入光路。按下“调100%”键，屏幕上显示“BL”延时数秒便出现“100.0”（T模式）或“000.0”、“-000.0”（A模式）。调100%T/ OA完成。
6.测量吸光度
6.1 参照操作步骤3、步骤4。
6.2 在吸光度（A）模式，参照步骤5调100%T/ OA。
6.3 用待测溶液荡洗比色皿2-3次，将待测溶液倒入比色皿，溶液量约为比色皿 高度的3/4，用擦镜纸将透光面擦拭干净，按一定的方向，将比色皿放入样品架。合上样品室盖，拉动样品架拉杆使其进入光路，读取测量数据。
7.测量透视比
7.1 参照操作步骤3、步骤4。
7.2 在透视比（T）模式，参照步骤5调100%T/ OA。
7.3用待测溶液荡洗比色皿2-3次，将待测溶液倒入比色皿，溶液量约为比色皿 高度的3/4，用擦镜纸将透光面擦拭干净，按一定的方向，将比色皿放入样品架。合上样品室盖，拉动样品架拉杆使其进入光路，读取测量数据。
8.浓度测量
8.1 参照操作步骤3、步骤4。
8.2 在透视比（T）模式，参照步骤5调100%T/ OA。
8.3用标准浓度溶液荡洗比色皿2-3次，将标准浓度溶液倒入比色皿，溶液量约为比色皿高度的3/4，用擦镜纸将透光面擦拭干净，按一定的方向，将比色皿放入样品架。合上样品室盖，拉动样品架拉杆使其进入光路。
8.4 按下“功能键”切换至浓度（C）模式。
8.5 按下“▲”或“▼”键，设置标准溶液浓度，并按下“确认”键。
8.6 用待测溶液荡洗比色皿2-3次，将待测溶液倒入比色皿，溶液量约为比色皿 高度的3/4，用擦镜纸将透光面擦拭干净，按一定的方向，将比色皿放入样品架。合上样品室盖，拉动样品架拉杆使其进入光路，读取测量数据。
9.斜率测量
9.1 参照操作步骤3、步骤4。
9.2 在透视比（T）模式，参照步骤5调100%T/ OA。
9.3 按下“功能键”切换至斜率（F）模式。
9.4 按下“▲”或“▼”键，设置样品斜率。
9.5 用待测溶液荡洗比色皿2-3次，将待测溶液倒入比色皿，溶液量约为比色皿 高度的3/4，用擦镜纸将透光面擦拭干净，按一定的方向，将比色皿放入样品架。合上样品室盖，拉动样品架拉杆使其进入光路，按下“确认”键（此时仪器自动切换至浓度（C）模式），读取测量数据。
10. 测量完毕
10.1 测量完毕后，清理样品室，将比色皿清洗干净，倒置晾干后收起。
10.2 关闭电源，盖好防尘罩，结束试验。
注意事项：
1、调100%T/ OA后，仪器应稳定5分钟再进行测量。
2、光源选择不正确或光源切换杆不到位，将直接影响仪器的稳定性。
3、比色皿应配对使用，不得混用。置入样品架时，石英比色皿上端的“Q”标记（或箭头）、玻璃比色皿上端的“G”标记方向应一致。
4、玻璃比色皿适用范围：320nm~1100nm，石英比色皿适用范围：200nm~1100nm。

第一步,知道你所需要测量物质的特征吸收波长是多少?这个可以在国家标准、行业标准或其他相关标准或方法.例如测量总氮的话,就需要220和275nm这2个波长,所以必须买紫外的光度计,并且最好带双波长测定功能,例如测总磷是697nm,只需买台可见光度计就可以了.
第二步,知道所测量的物质的实验方法,需要哪些仪器和设备,还有玻璃器皿等,同时还有比较完成测量所需要的所有化学试剂等.这个可以在标准或实验方法中找到,基本在互联网上都可以找到电子版的测量方法.
第三步,配置好所需测量物质的标准浓度溶液,一般是5-8个标准溶液,浓度建议从高到低,建议每个不同浓度贴上标签,以防顺序搞错.注意,部分实验需要往标准溶液中加显色剂之后才可以用光度计进行测量.
第四步,设置好光度计的测量波长,这就需要熟悉光度计的基本操作,一般测量物质的浓度都是用的标准曲线法,就是对应光度计中的定量测量功能.具体操作时第一步,把仪器的波长调整到我们所需要的波长,例如测量总磷直接把波长走到697nm,之后放入装好蒸馏水的比色皿到样品室做空白,就是熟称的调零.第三部把标准溶液放入样品室,依次测量他们的吸光度,仪器一般会自动记录之后就会给出标准曲线方程,实验完毕.如果仪器不能直接记录吸光度,可以先记在笔记本上,之后用excel软件进行计算标准曲线.判断做出的标准曲线是否能用,看哪个R值即那个相关系数,一般最少做出0.999就可以用了,差一点的仪器也可以做出0.99.
第五步,把未知样品放入样品室就可以直接测量出样品浓度.