酶活力测定的注意事项有哪些?

按照标准执行。

标准曲线

1．底物浓度 除选择适合的底物外,在实际应用中更多考虑的是底物浓度.由于[S]与反应速度V成双曲线关系,在酶活性测定时,要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比.[S]范围一般选择在10～20Km为宜,此时反应速度基本达到最大反应速度,测定的误差在可接受范围.
2．酶浓度 在反应条件一定时,酶浓度与反应速度成正比.按照中间产物学说,只有[S]>>[E]时,酶才能被底物分子饱和,反应速度才能达到最大值.因此当标本酶活力过高时,应将标本适当稀释后再加以测定.
3．温度 不同的酶最适温度可以不同,多数酶的最适温度在37～40℃,高于或低于最适温度,酶活性都降低.目前,酶活性的测定温度尚未统一,但常规实验室多使用37℃.温度对酶促反应的影响程度通常用温度系数(Q10)表示.温度系数指温度每升高10℃,化学反应速度增加的倍数.Q10通常为l～2.由温度系数得知,温度的变化对酶活性有着重要影响,因此要求酶活性测定要在恒温条件下进行,温度波动要控制在±1℃.
4．离子强度和pH值 在最适pH时,酶的活性最强,高于或低于最适pH,酶的活性都降低,多数酶的最适pH在5～8之间.在测定酶活性时,要求缓冲液具有足够的缓冲容量,以便使pH值保持稳定.血浆或血清标本含有多种缓冲溶质,具有较强的缓冲能力.为了防止血浆或血清标本缓冲溶质对反应液酸碱度的影响,使pH不致偏离设定值,标本用量不宜过大,血浆或血清标本体积／反应液体积≤1／10为宜.
5 辅助因子 某些金属离子和维生素类辅酶是结合酶的辅助因子,例如Zn2+是羧基肽酶的辅基,Mo6+是黄嘌呤氧化酶的辅基,NADH是不需氧脱氢酶的辅酶.这些酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性,因此在酶活性测定时,就要保证辅基或辅酶的供给.
6．激活剂 有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高,例如Mg2+是肌酸激酶的激活剂,Cl-是淀粉酶的激活剂.因此在酶活性测定时,也要满足酶对激活剂的需要.
7．抑制剂 酶的抑制可分为不可逆抑制和可逆抑制,后者又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制.重金属离子和砷化物对巯基酶的抑制、有机磷对羟基酶的抑制属于不可逆抑制；丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制、磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的抑制属于竞争性抑制；哇巴因对Na+,K+-ATP酶的抑制属于非竞争性抑制.抑制剂使酶活性降低,在测定酶活性时,应避免抑制剂的影响.
综上所述,测定酶活性时,最适条件的选择应该遵循最适底物浓度、最适温度、最适pH值、满足辅助因子和激活剂、避免抑制剂的原则.