双向电泳第二步SDS-PAGE跑胶的问题
双向电泳第二步SDS-PAGE跑胶的问题
主要有2个问题：
第一：跑出来的胶有很多的横着竖着的条带,不知道是蛋白没有分开还是怎么的.看Bio-Rad上面写的问题分析说可能是蛋白被污染了,所以加了DNAse I和RNase A在最开始的蛋白里面,不过效果还是不好,依然有很多条带.
第二：把第一条strip放在成品胶（SDS-PAGE的那个胶）顶部,用琼脂（agarose）凝固了2个小时,然后再跑SDS-PAGE.跑前这块成品胶都好好的,但是跑完胶（2个小时）以后,成品胶就连同上面的strip一起被挤出了原来的槽子.有朋友说可能是跑胶的时候温度太高,让胶胀大了.我就把胶放在4度的冷冻室里面跑,但是成品胶还是被挤出来了,这样会影响从strip里面转到成品胶的蛋白量.
1,提取蛋白的时候要充分超声粉碎,然后高速离心.吸取上清的时候不要触到沉淀.污染不一定是RNA和DNA,还有可能是胶里面有杂质.
2.遇热膨胀过度,你可以在电泳槽里面安放冰槽,电泳液预先降温,同时降低电泳时的电流.还有配琼脂也要用缓冲液,而不是水,不然不导电.接触不好也会引起条带变形我要的蛋白分子量大概是40K-130K的，那应该用多少g离心比较好呢？我是在120V下面跑了2个小时，4度的环境，没有单独设置电流，那应该用多大的电流比较好？琼脂是买的Bio-Rad的商品琼脂，好像也没办法单独加缓冲液。刚刚你这么一说，我突然想到我的琼脂是热到73度左右就直接加在胶上面了，是不是这个温度不合适？那应该用什么温度啊？多谢了！一般离心12000 x g，10分钟120v 2小时，肯定要升温的。可以多试几个，降低电压，延长时间。琼脂买回来是粉吧，配置的时候要加缓冲液，而不是水来加热融化。如果买的是冻结的琼脂，要保证充分加热溶解，知道没有肉眼可见的颗粒才行。加热的温度不用担心，反正要等冷了才跑的