要得到正确的革兰氏染色结果注意哪些操作,哪一步是关键步骤

革兰氏染色：
（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同.
（2）晾干：与简单染色法相同.
（3）固定,与简单染色法相同
（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上,加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟.
（5）水洗：倾去染色液,用水小心地冲洗.
（6）媒染：滴加卢哥氏碘液,媒染1min.
（7）水洗：用水洗去碘液.
（8）脱色：将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色,立即水洗.
（9）复染：滴加蕃红复染5min.
（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液.
（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干.
（12）镜检：镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性.
（13）实验完毕后的处理：
①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净,a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去.b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次.c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次.注意擦镜头时向一个方向擦拭.
②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净.
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色.如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌.脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响,难以严格规定.
2.染色过程中勿使染色液干涸.用水冲洗后,应吸去玻片上的残水,以免染色液被稀释而影响染色效果.
3.选用幼龄的细菌.G+菌培养12h-16h,E.coli培养24h.若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应.