、菌种贮存条件

菌种保藏技术
菌种是主要的生物资源,也是食用菌生产首要的生产资料.一个优良的菌种被选育出来以后,必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变,才不至于降低生产性能,能长期在生产中使用.因此,菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义.
一、菌种保藏原理
菌种保藏的方法很多,但原理大同小异.首先要挑选优良纯种.利用微生物的孢子、芽孢及营养体；其次,根据其生理、生化性,人为创造低温、干燥或缺氧等条件,抑制微生物的代谢作用,使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态,从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状,防止变异.不管采用哪种保藏方法,在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化.
二、菌种保藏的方法
1、低温定期移植保藏法.将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上,适温培养,当菌丝健壮地长满斜面时取出,放在3-5℃低温干燥处或4℃冰箱、冰柜中保藏,每隔4-6个月时间移植转管一次,具体应根据菌种特性决定.保藏时要注意环境温度不能太高,以防霉菌通过棉塞进入管内.因此,若用棉塞,可用干净的硫酸纸或牛皮纸包扎棉塞,即可减少污染的机会,也可防止培养基干燥.除草菇菌种外,其他食用菌菌种都能采用此法保藏.
2、液体石蜡保藏法.取化学纯液体石蜡（要求不含水分、不霉变）装于三角瓶中加棉塞并包纸,在1公斤/平方厘米压力下灭菌1小时,再放入40℃恒温箱中数天,以蒸发其中水分,至石蜡油完全透明为止.将处理好的石蜡油移接在空白斜面上,28-30℃下培养2-3天,证明无杂菌生长方可使用.然后用无菌操作的方法把液体石蜡注入待保藏的斜面试管中.注入量以高出培养基斜面1-1.5厘米,塞上橡皮塞,用固体石蜡封口,直立于低温干燥处保藏.保藏时间在一年以上,在低温下,保藏时间还可延长.
3、沙土管保藏法.取河沙用水浸泡洗涤数次,过60目筛除去粗粒,再用10%盐酸浸泡2-4小时,除去其中有机物质,再用水冲洗至流水的ph达到中性,烘干备用.同时取贫脊土或菜园土用水浸泡,使呈中性,沉淀后弃去上清液,烘干碾细,用100目筛子过筛,将处理好的沙与土以（2-4）:1混匀,用磁铁吸出其中的铁质,然后分装小试管或安瓿内,每管装量0.5-2克,塞棉塞,用纸包扎灭菌（1.5公斤/平方厘米,1小时）,再干热灭菌（160℃,2-3小时）1-2次,进行无菌检验,合格后使用.将已形成孢子的斜面菌种,在无菌条件下注入无菌水3-5毫升,刮菌苔,制成菌悬液,再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中,以浸透砂土为止.将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内,接上真空泵抽气数小时,至沙土干燥为止.真空干燥操作需在孢子接入后48小时内完成,以免孢子发芽.制备好的沙土管用石蜡封口,在低温下可保藏2-10年.
4、滤纸片保藏法.取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）滤纸,剪成4×0.8厘米的小纸条,平铺在培养皿中用纸包裹进行灭菌（1公斤/平方厘米,30分钟）.采用钩悬法收集孢子,让孢子落在滤纸条上.将载有孢子的滤纸条放入保藏试管中,再将保藏试管放入干燥器中1-2天,除去滤纸水分,使滤纸水分含量达2%左右,然后低温保藏.
5、自然基质保藏法
⑴麦粒保藏法：取无瘪粒、无杂质的小麦淘洗干净,浸泡12-15小时,加水煮沸15分钟,继续热浸15分钟,使麦粒胀而不破,沥干水分摊开晾晒,使麦粒的含水量在25%左右.将碳酸钙、石膏拌入熟麦粒中（麦粒、碳酸钙、石膏比例为10公斤:133克:33克）,拌和均匀后装入试管中,每管约2-3克,然后清洗试管,塞棉塞,灭菌1.5（1.5公斤/平方厘米,2小时）,经无菌检查合格后备用,试管基质冷却后接种,适温培养,待菌丝长满基质后用石蜡涂封棉塞,放低温保藏.2年左右转接一次.
⑵麸曲保藏法.取新鲜麸皮,过60目筛除去粗粒.将麸皮和自来水按1:1拌匀,装入小试管,每管约装1/3高度,加棉塞用纸包扎,高压灭菌（1.5公斤/平方厘米,30分钟）,经无菌检查合格后备用,将生长在斜面培养基上的健壮菌种,移种至无菌麸曲管中,移种时注意尽管捣匀小试管中的麸皮,呈疏松状态,在适温下培养至菌丝长满麸皮为止,将麸曲小管置干燥器中,在低温或适温下保藏.
6、生理盐水保藏法.取纯氯化钠0.7-0.9克,放入100%毫升蒸馏水中,搅拌均匀分装试管,每管5-10毫升,进行灭菌（1公斤/平方厘米,30分钟）,经无菌检查合格后备用,将待保藏的菌种接入马铃薯葡萄糖液体培养基中适温振荡培养5-7天.无菌操作吸取少许培养菌种注入经检验合格的生理盐水试管中,塞上无菌橡皮塞,用石蜡涂封,在室温或低温保藏.
7、冷冻真空干燥法.将已培养、生长丰富的菌体或孢子悬浮于灭菌的血清、卵白、脱脂奶制成菌悬液,将悬液以无菌操作分装于灭菌的玻璃安瓿瓶中,每管约0.3-0.5毫升,然后用耐压橡皮管与冷冻干燥装置连接,安瓿瓶放在冷冻槽中于-30℃至-40℃迅速冷冻,并在冷冻状态下抽空干燥,并在真空状态下熔封安瓿,在-20℃保存,一般可保存十年以上,但成本较高.
8、液氮超低温保藏法.首先将要保藏的菌种制成菌悬液备用；其次,准备安瓿瓶,每瓶加入0.8毫升冷冻保护剂10%（体积比）甘油蒸馏水溶液,塞棉塞灭菌（1公斤/平方厘米,5分钟）.无菌检查后,接入要保藏的菌种,火焰熔封瓶口,检查是否漏气,将封好口的安瓿瓶放在冻结器内,以每分钟下降1℃的速度缓慢降温,使保藏品逐步均匀地冻结,直至-35℃,以后冻结速度就不需控制,安瓿冻结后立即放入液氮罐内,在-150至-196℃保藏,该法只有少数科研院所使用.