微生物复习-微生物的生长繁殖及其控制

第五章 微生物的生长繁殖及其控制
重点：细菌生长曲线的定义、各时期的特点、应用及生产指导意义.控制微生物生长繁殖及控制微生物生长的条件及原理.
微生物在适宜的环境条件下,不断地吸收营养物质,并按照自己的代谢方式进行代谢活动,如果同化作用大于异化作用,则细胞质的量不断增加,体积得以加大,于是表现为生长.简单地说,生长就是有机体的细胞组分(constituent)与结构在量方面的增加.单细胞微生物如细菌,生长往往伴随着细胞数目的增加.当细胞增长到一定程度时,就以二分裂方式,形式两个基本相的子细胞,子细胞又重复以上过程.在单细胞微生物中,由于细胞分裂而引起的个体数目的增加,称为繁殖.在多细胞微生物中,如某些霉菌,细胞数目的增加如不伴随着个体数目的增加,只能叫生长,不能叫繁殖.例如菌丝细胞的不断延长或分裂产生同类细胞均属生长,只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做繁殖.
在一般情况下,当环境条件适合,生长与繁殖始终是交替进行的.从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程,这个过程就是发育.
微生物处于一定的物理、化学条件下,生长、发育正常,繁殖速率也高；如果某一或某些环境条件发生改变,并超出了生物可以适应的范围时,就会对机体产生抑制乃至杀灭作用.
第一节细菌纯培养的群体生长规律
大多数细菌的繁殖速度都很快.大肠杆菌的适宜条件下,每20分钟左右便可分裂一次,如果始终保持这样的繁殖速度,一个细菌48个小时内,其子代总重量可达2.2×10 31克,这是一个巨大的数字.然而,实际情况是不可能的.那么,细菌的群体生长规律到底怎样呢?
一、细菌纯培养的群体生长规律（详细讲解,让学生理解并掌握）
将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中,在适宜的条件下培养,定时取样测定细菌含量,可以看到以下现象：开始有一短暂时间,细菌数量并不增加,随之细菌数目增加很快,继而细菌数又趋稳定,最后逐渐下降.如果以培养时间为横坐标,以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图,可以得到如图6-6的曲线,称为繁殖曲线,对单细胞微生物而言,虽然生长和繁殖是两个不同的概念,但由于在测定方法上,多以细菌数增加(即繁殖)作为生长指标,它们的繁殖也可视为群体的生长,所以,繁新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化.根据细菌生长繁殖速率的不同,可将生长曲线大致分为延迟期、对数期、调整期或滞留适应期.
（一）延迟期 处于延迟期细菌细胞的特点可概括为8个字：分裂迟缓、代谢活跃.细胞体积增长较快,尤其是长轴,例如巨大芽孢杆菌,在延迟期末,细胞平均长度比刚接种时大6倍以上；细胞中RNA含量增高,原生质嗜碱性加强；对不良环境条件较敏感,对氧的吸收、二氧化碳的释放以及脱氨作用也很强,同时容易产生各种诱导酶等.这些都说明细胞处于活跃生长中,只是细胞分裂延迟.在此阶段后期,少数细胞开始分裂,曲线略有上升.
延迟期出现的原因,可能是为了调整代谢.当细胞接种到新的环境(如从固体培养接种至液体培养基)后,需要重新合成必需量的酶、辅酶或某些中间代谢产物,以适应新的环境.
延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关,短的只需几分钟,长的可达几小时.因此,深入了解延迟期产生的原因,采取缩短延迟期的措施,在发酵工业上具有十分重要的意义.在生产实践中,通常采取的措施有增加接种量,在种子培养中加入发酵培养基的某些营养成分,采用最适种龄(即处于对数期的菌种)的健壮菌种接种以及选用繁殖快的菌种等措施,以缩短延迟期,加速发酵周期,提高设备利用率.
在延迟期末,每个细胞已开始分裂,但并非所有的机体都同时结束这一时期,所以细菌数逐渐增加,曲线稍有上升,直至这一阶段结束,进入下一阶段.
(二) 对数期(log phase) 对数期又称指数期(exponential phase).在此期中,细胞代谢活性最强,组成新细胞物质最快,所有分裂形成的新细胞都生活旺盛.这一阶段的突出特点是细菌数以几何级数增加,代时稳定,细菌数目的增加与原生质总量的增加,与菌液混浊度的增加均呈正相关性.这时,细菌纯培养的生长速率也就是群体生长的速率,可用代时(generation time)表示.所谓代时,即单个细胞完成一次分裂所需的时间,亦即增加一代所需的时间(也叫增代时间或世代时间).在此阶段,由于代时稳定,因此,只要知道了对数期中任何两个时间的菌数,就可求出细菌的代时.
不同的细菌,其对数期的代时不同,同一种细菌,由于培养基组成和物理条件的影响,如培养温度、培养基pH、营养物的性质等,代时也不相同.但是,在一定条件下,各种菌的代时又是相对稳定的,多数种为20-30分钟,有的长达33小时,而有的繁殖极快,增代时间只9.8分左右.表6-4示不同细菌的代时.
处于对数期的微生物,其个体形态、化学组成和生理特性等均较一致,代谢旺盛,生长迅速,代时稳定,所以是研究基本代谢的良好材料,也是发酵生产的良好种子,如果用作菌种,往往延迟期很短以至检查不出,这样可在短时间内得到大量微生物,以缩短发酵周期.
(三) 稳定期(stationary phase) 又称恒定期或最高生长期.处于稳定期的微生物,新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等,整个培养物中二者处于动态平衡,此时生长速度,又逐渐趋向零.
在一定容积的培养基中,细菌为什么不能按对数期的高速率无限生长呢?这是由于对数期细菌活跃生长引起周围环境条件条件发生了一系列变化,某些营养物质消耗,有害代谢产物的积累,以及诸如pH、氧化还原电位、温度等的改变,限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂.
此阶段初期,细菌分裂的间隔时间开始延长,曲线上升逐渐缓慢.随后,部分细胞停止分裂,少数细胞开始死亡,致使细胞的新生与死亡速率处于动态平衡.这时培养物中细胞总数达到最高水平,接着死亡细胞数大大超过新增殖细胞数,曲线出现下降趋势.
稳定期的细胞内开始积累贮藏物,如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等,大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢.如果为了获得大量菌体,就应在此阶段收获,因这时细胞总数量最高；这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段,某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期.
从上可以看出,稳定期的微生物,在数量上的达到了最高水平,产物的积累也达到了高峰,此时,菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系,这种关系,生产上称为产量常数,可用下式表示：
γ=菌体总生长量/消耗营养物质总量
式中γ值的大小可说明该种细菌同化效率的高低.根据这一原理,可用适当的微生物作为指示,对维生素、氨基酸或核苷酸等进行定量的生物测定.稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关.生产上常常通过补料、调节pH、调整温度等措施,延长稳定期,以积累更多的代谢产物.
(四) 衰亡期(decline hpase) 稳定期后如再继续培养,细菌死亡率逐渐增加,以致死亡数大大超过新生数,群体中活菌数目急剧下降,出现了"负生长",此阶段叫衰亡期.其中有一段时间,活菌数换几何级数下降,故有人称之为"对数死亡阶段".这一阶段的细胞,有的开始自溶,产生或释放出一些产物,如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等.菌体细胞也呈现多种形态,有时产生畸形,细胞大小悬殊,有的细胞内多液泡,革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等.在学习细菌生长曲线的有关知识时,应注意各生长期之间的过渡阶段.从图6-6可以看到培养物是逐步地从一个生长期进入到下了个生长期的.也就是说,并不是所有细胞在接近某一生长期的末尾时均处于完全相同的生理状态,因此,在细菌生长的整个周期,细菌数和培养时间,若以线性关系表示,往往是一条缓慢上升以后又逐渐下降的曲线,而不是一个阶段分明的直线.
认识和掌握细菌生长曲线,不仅对指导发酵生产具有很大作用,而且对科学研究也是十分必要的.例如,为了得到研究材料,往往少不了要预计一细胞群体生长到一定数量水平需要多长时间,这就必须计算生长速率和代时.另外,正确认识正常生长曲线的完整意思也很重要,在某个生长时期细胞年幼而代谢活跃,哪个时期细胞老化并濒于死亡,因不同生长期的细胞在结构和生理上可能有很大差别,了解了这些,就能根据需要进取样和收获.同时,在不同的生长期里理化因子对微生物的影响了可能不同.一般来说,对数生长期的细胞较为一致,因此常用于研究细胞的新陈代谢.
二、微生物生长的测定（详细讲解,让学生理解）
微生物特别是单细胞微生物,体积很小,个体的生长很难测定,而且也没有什么实际应用价值.因此,测定它们的生长不是依据细胞个体的大小,而是测定群体的增加量,即群体的生长.例如用直接或间接的方法测定群体的增加量；或测定群体的原生质量；或测定细胞中某些生理活性的变化等.就一般单细胞微生物而言,尤其在对数生长期,像细菌的生长量与细菌的数目之间完成是一种正比例关系.因此,某些情况下,细菌的数目就表示了它的生长量.测定生长量的方法很多,概括起来有以下几种.
(一) 直接计数法(又称全数法)
1. 涂片染色法 将已知体积的待测材料,均匀地涂布在载玻片的已知面积上,经固定染色后,在显微镜下计算染色涂片上的细菌数.一般在载玻片一平方厘米的面积上,均匀涂布0.01毫升样品.很显然,在显微镜下要观察整个涂布区域是较困难的,因此,人们常常任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞的数量.如果借助镜台测微尺测得视野的直径,就可计算了.视野的面积(面积=πr2,r为视野的半径),然后用一平方厘米内的视野数乘以每个视野中的细胞平均数,再乘以100(因只用了0.01毫升样品涂布),就等于每毫升菌液的细胞数.其计算公式如下：
每毫升原菌液含菌数=视野中的平均菌数×1cm 2/视野面积×100×稀释倍数
2.计数器测定法 用特制的细菌计数器或血球计数器进行计数.取一定容积稀释的单细胞微生物悬液置于计数器载玻片与盖玻片之间的计数室内.由于计数室的容积是己知的(总面积为1平方毫米,高0.1毫米),并有一定刻度.因此,可根据计数器刻度内的细菌数,计算出样品中的含菌数.
根据计数器小格数目的不同,可概括成两个换算公式：
(1) 16个中格×25个小格的计数器：每毫升原菌液含菌数=100小格内菌数100×400×10,000×稀释倍数
(2) 25个中格×16个小格的计数器：每毫升原菌液含菌数=小格内菌数80×400×10：000×稀释倍数
上述两种计数器有一个共同特点,即每一个大方格均由16×25=400个小方格组成,故可将上面两个公式归纳成一个通式：
每毫升原菌液含菌数=每小格平均菌数×4,000,000×稀释倍数
3.比例计数法 将待测的细菌悬液与等体积血液混合后涂片,在显微镜下可以测得细菌数与红细胞数的比例.由于每毫升血液中红细胞数是已知的,如正常的男性每立方毫米血液中约含400-500万个,女性约为350-450万个.这样,通过细菌数与红细胞数的比例,就可计算出每毫升样品中的细菌数.如果测定空气和水中的微生物时,由于含菌数低,需将一定体积的样品通过特制的滤器进行浓缩.
上述三种方法都属于显微镜直接计数法.这些方法虽然较麻烦,但在许多有关微生物生长的研究工作中却很重要.然而也有一定的局限性,主要表现在：死、活细胞不易区分；小的细胞很难在显微镜下观察,有一些细胞可能被遗漏；浓度太低的细胞悬液也不能使用此法,可以计数的最低的群体细胞数与细胞大小有关,就大多灵敏细菌而言,群体数必须每毫升悬液中含菌10 6个以上；精确性也较差.
4.电子自动计数器计数法 电子计数器的工作原理,就是测定一个小孔中液体的电阻变化.
电子自动计数器具有一个特制的有孔玻璃薄膜,当定量的细胞悬液中的菌体高速地通过小孔时,由于悬液与菌体的导电性不同,使得小孔的电导下降,电阻强率明显增加,并形成一个脉冲,自动记录在电子记录尺标装置上.这样,一份已知体知的含有待测细胞的菌悬液,让其通过这一小孔,每当一个细胞通过时就就产一个脉冲被记录下来.此设备可以高速测定菌数,而且结果也较精确.但是电子计数器不能区别其他颗粒,因此,菌悬液中应无其他碎片.
5.比浊法 这是测定悬液中细胞数的快速方法.其原理是悬液中细胞浓度与混浊度成正比,与透光度成反比.菌体是不透光的,光速通过菌悬液时则会引起光的散射或吸收,从而降低透光量.细菌越多,透光量越低.因此,测定菌悬液的光密度或透光度可以反映细胞的浓度.而光密度或透光度又可借光电池精确地测得.然后将未知细胞数的悬液与已知细胞数的悬
液相比,可以从已知悬液的稀释倍数,求出未知悬液所含的细胞数.此法比较简便.但使用时必须注意：样品颜色不宜太深；样品中不要混杂其他物质,否则不能使用；同时菌悬液浓度必须在10 7/毫升以上才能显示可信的混浊度.
(二) 间接计数法(又叫活菌计数法)
直接计数法测定的是死、活细胞总数.在多数情况下,人们所关心的是计算活菌数.间接计数法是基于每个分散的有机体在适宜的培养基中具有生长繁殖的能力,并且一个活细胞能形成一个菌藩.因此,菌落数就是待测样品的含的活菌数.此法所得的数值往往比直接法测定的数字小.
1.平皿菌落计数法 像稀释平皿分离法一样,先将待测菌液作一系列10倍稀释,使平皿上长出的菌落数在30-300个之间.然后将最后三个稀释度的稀释液各取一定量(一般为0.2毫升)与融化并冷至45℃左右的琼脂培养基一起,倾入无菌平皿中摇匀,静置,待凝固后进行保温培养,通过平皿上出现的菌落数,便可推算出原菌液含菌数.计算公式：
总活菌数/毫升=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5
此法由于个人掌握程度的不同,结果常不稳定.其成败关键在于应使样品充分均匀,而且每个稀释度的菌液应各用一支无菌吸管,以减少吸管壁因存在油脂等物粘上细菌而影响计数的精确度(否则,有时误差高达15%左右).为克服这一弱点,近年来有人对此法作了改进.他们认为,对原菌液浓度为10-9/毫升的微生物来说,如果第一次稀释采用10-4级(即用毛细吸管吸菌液10微升至100毫升的无菌水中),第二次稀释则采用10-2级(即吸1毫升上述稀释菌液于100毫升无菌水中),然后再吸0.2毫升此菌液进行平皿菌落计数(采用表面涂布法),其结果较为精确可靠(图6-4).
平皿菌落计数法是教学、生产、科研中最常见的一种活菌计数法.它不仅适用于多种材料,而且,即使样品中含菌数量极少也可以测出.常用于测定水、土壤、牛奶、食品及其他材料中的活菌数.必须注意的是：并非所有生活有机体都要在实验条件下或实验期间内生长并形成菌落,如果在待测样品中含有不同生理类型的有机体时更是如此.此外,意外的损伤也可导致菌数减少,例如有些细菌,可能在稀释和倾倒平皿等过程中遭到损伤,造成人为的误差.处于融化状态的琼脂培养基温度较高,某些易受热力影响的微生物往往不能存活；加之人们无法看出产生菌落细胞,因而不能绝对肯定一个菌落仅来源于一个细胞,以致造成实验误差.
2.稀释法 奖待测样品作一系列稀释,一直稀释到该稀释液的少量(如1毫升)接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖.根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度(即临界级数),再用"或然率"理论,可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值.具体的说,菌液经多次稀释后,一定量菌液中可以极少甚至无菌,然后将待测液于液体培养基中,按十倍稀释度作一系列稀释,每个稀释度取3-5次重复,培养后,将有细胞生长的最的三个稀释度中的出现细菌生长的管数作为数量指示,由统计分配表(表6-2)上查出近似值,再乘以数量指标第一位数的稀释倍数,即为原菌液中的含菌数.例如：某一细菌在稀释法中的生长情况如下：
根据上述结果,其数量指标为"541",查统计分配表得近似值为17.然后乘以第一位数的稀释倍数(10-5的稀释倍数为100,000).那么,原菌液中的活菌数=17×100,000=10 5.即每毫升原菌液中含活菌为1,700,000个.统计分配表根据重复次数不同分为三次重复测数统计表,四次重复测数统计表和五次重复测数统计表(又称五管最或然数表).
在实践中,通常以五管重复为一个组,故这里仅列出了五次重复测数统计表.只要知道了数量指标,就可查知近似值.
例1 经巴斯德消毒的牛奶样品作10 0、10-1、10-2稀释,每个稀释度作五管重复,每个重复管中加入1ml小份样品接种,培养后,100五管均出现生长10-1有三管生长,而10-2没有生长,其数量指标为530,从表6-2查出近似值是7.9,则每毫升牛奶含活菌为：7.9×10个.
例2 牛奶样品作10-3、10-4、10-5稀释,同上法各取五个1毫升小份稀释的样口接种,经培养,10-3有四管生长,10-4有两管生长,而10-5没有生长.其数量指标为420.从表6-2查出近似值是2.2,由于数量指标的第一位数的稀释倍数是1,000,故每毫升牛奶中含活菌为：2.2×10 3个.此方法只有因某种原因不能使用琼脂平皿菌落计数时才采用.
从前面可看出,活菌计数法尽管有一定的局限性,但它却能提供其他方法不能获得的资料,所以在食品、奶品、医学及卫生微生物学中经常采用.为了消除上述方法的复杂性,现在不论是培养基、培养条件或是稀释方法、计算方法,以及结果分析和解释等方面,通过多年的实践,都制订了严格的标准.
如果测定量大而且含菌浓度很低样品(如空气、水等)中的活菌数时,则应将待测样品通过微孔薄膜(如硝化纤维素薄)过滤浓庥,再与膜一起放到培养基或浸透了培养液的支持物表面培养,然后根据菌藩数推知样品含菌数.
(三) 测定细胞物质量
1.测定细胞总含氮量来确定细菌浓度 蛋白质是细胞的主要物质,含量比较稳定,而氮又是蛋白质的重要组成.其方法要点：从一定量培养物中分离出细菌,洗涤,以除去培养基带入的含氮物质.再用凯氏定氮法法测定总含氮量,以表示原生质含量的多少.一般细菌的含氮量约为原生质干重的14%.而总氮量与细胞蛋白质总含量的关系可用下式计算：
蛋白质总量=含氮量%×6.25
此法只适用于细胞浓度较高的样品,同时操作过程也较麻烦,故主要用于科学研究.
2.DNA含量测定法 利用DNA与DABA-2HCl(即新配制的20%W/W,3,5-二氨基苯甲酸-盐酸溶液)能显示特殊荧光反应的原理而设计的.将一定容积培养物的菌悬液,通过荧光反应强度,求得DNA的含量,可以直接反映所含细胞物质的量.同时还可根据DNA含量计算出细菌的数量.因为每个细菌平均含DNA8.4×10-5纳克.
3.测定细胞干重法 单位体积培养物中,细胞的干重可用来表示菌体的生长量.将单位体积培养液中的菌体,以清水洗净,然后放入干燥器内加热或减压干燥.其菌体干重可直接用精密仪器测定.一般来说,细菌的干重约为湿重的20-25%,即1毫克干菌体=4-5毫克湿菌体=4-5×10 9个菌体.此法较为直接而又可靠,主要用于调查研究.但只适用于菌体浓度较高的样品,而且要求样品中不含非菌体的干物质.
4.基他生理指标测定法 微生物新陈代谢的结果,必然要消耗或产生一定量的物质,以表示微生物的生长量.一般生长旺盛时消耗的物质就多,或者积累的某种代谢产物也多.例如通过测定微生物对氧的吸收、发酵糖产酸量、或测定谷氨酸在氨基脱羧酶作用下产生CO2的多少来推知细菌生长情况.这是一种间接方法.使用时必须注意：作为生长指标的那些生理活动项目,应不受外界其他因素的影响或干扰.
可以看出,每种方法都各有优点和局限性.只有在考虑了这些因素同要着手解决的问题之间的关系以后,才能对具体的方法进行选择.正如前面说过的,平皿菌落计数法是微生物学中应用最多的常规方法,掌握这一方法的原理和实际操作,很有必要.但此法在理论上仅能反映活细胞数.另外,当用两种不同的方法测量细菌的生长量时,其结果不一致是完全可能的,例如对静止期培养物进行显微镜计数时比平皿菌落计数法所得的数字高得多,因前者包括所有的活细胞与死细胞.而后者只能反映出活细胞数.
测定微生物生长量,在理论研究和实际应用中都十分重要.当我们要对细菌在不同培养基中或不同条件下的生长情况进行评价或解释时,就必须用量的术语来表示生长.例如,可以通过细菌生长的快慢来判断某一条件是否适合.生长快的条件,最终的细胞总收获量可能没有另一些条件下的收获量大.在另一些条件下,生长速率虽然较低,但它却可在一段较长的时间内不断增加.这种情况可用衅6-5表示.这是同一种菌在两种不同的培养基上生长情况的比较.这种菌在两种培养里都能生长.假如在A时测量生长,可以断定在培养基Ⅱ里生长快；若在B时测量,则在两种培养基上都生长得很好；可是在C时测量,却在培养基Ⅰ里生长好些.据此,我们就可以根据需要进行选择了.如果培养目的是要机体生长得早而快,就选用培养基Ⅱ；如果是要得到大量的细胞,就应选用培养基Ⅰ.因此,只有具备了有关生长的定量方面的知识,才能在实际应用中作用正确的选择,以利科研和生产.
三、连续培养（详细讲解,让学生理解并掌握）
将微生物置于一定容积的培养基中,经过培养生长,最后一次收获,此称分批培养(batch culture).通过对细菌纯培养的生长曲线的分析可知,在分批培养中,培养基一次加入,不予补充,不再更换.随着微生物的活跃生长,培养基中营养物质逐渐消耗,有害代谢产物不断积累,细菌的对数生长期不可长时间维持.如果在培养器中不断补充新鲜营养物质,并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢产物),理论上讲,对数生长期就可无限延长.只要培养液的流支量能使分裂繁殖增加的新菌数相当于流出的老菌数,就可保证培养器中总菌量基本不变.50年代出现的连续培养(continuous cultivation)技术就是据此原理而设计的,这种方法就叫连续培养法.连续培养方法的出现,不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料,而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水平.此法已成为当前发酵工业的发展方向.
最简单的连续发酵装置包括：培养室、无菌培养基容器以及可自动调节流速(培养基流入,培养物流出)的控制系统,必要时还装有通气、搅拌设备.连续培养装置的一个主要参数是稀释率(D),它的定义为：D=FV=流动速率容积.控制连续培养的方法主要有两种：