如何建立高效液相色谱法测定含量的方法

1 色谱条件的确定
专属性是色谱条件建立的关键通常是采用
在被测物对照品(或供试品)中加入适量的杂质或辅
料以验证所选色谱条件能否将各杂质与被测物
分离检出
[2]
.应按1(w/w)被测物浓度的各杂质量
添加至被测物中模拟被测物中可能存在杂质的
状态即有少量(约1)杂质存在时能否与被测物
达到完全分离(分离度大于1.5)以验证系统适用
性.只有这样才能较为客观、科学地反映被测物的
实际情况.而不应将被测物与各杂质配制成相同浓
度的溶液因为实际检测中不可能存在这种情况
且该浓度也不易确定.在实际检测时由于被测物
浓度较大很易将相邻杂质峰包含其中.另外还需
测定溶剂和辅料(检测制剂时)是否有干扰.目前
美国药典(USP)、英国药典(BP)及许多进口产品的
质量标准中有关物质测定方法学的专属性验证均
采用此法.还须说明的是杂质与杂质峰间的分离
度达1.2即可而被测物与其相邻杂质峰的分离度
必须大于1.5.
2 检测波长的选择
有关物质检测的研究对象是杂质而非被测
物.但测定则是通过各自的峰面积来表达故波长
的选择必须考虑被测物和各杂质在检测波长下的校
正因子(f)是否相同.应分别制备相同浓度的被测
物与各杂质溶液经紫外扫描后以吸光度相近的波
长为检测波长.在该检测波长下分别进样测定
由各峰面积计算校正因子.若f为0.81.2则表明
被测物与各杂质的f相同可消除f的影响.若f≤0.8
或f ≥1.2则应在计算时加入f.目前通常以被测物
的最大吸收波长为检测波长、不加校正因子的计算
方法而未综合考虑各杂质的f.
3 供试品溶液浓度的确定
供试品溶液浓度的确定也非常重要.虽然浓度
越高越能反映被测物中杂质存在的情况但若设定
过高会产生主峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载等情况若设定过低则灵敏度不够无法
检测杂质及其含量变化.
最低检出浓度的测定可分为信噪比法和直接评
价法两种
[3]
.后法是目前较为科学的做法即将仪
器的灵敏度调至较适宜的值(仅对灵敏度可调节的
仪器而言目前市场上主流品牌的液相色谱仪均已
设定了一个恒定、较为灵敏的值)然后将被测物
溶液不断稀释后进样测定直至被测物峰面积无法
检出为止此时的浓度即为最低检出浓度.
最大进样量则是采用不断增加被测物溶液浓
度直至峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载
等情况出现.
根据最低检出浓度采用“上推法”来确定
供试品溶液浓度如一般设定杂质总量小于1.0
对照液对照溶液的浓度至少应为最低检出浓度的
2050倍供试品溶液浓度则应是最低检出浓度的
20005000倍.同时还应考虑仪器、色谱柱等因
素对最低检出浓度和最大进样浓度的影响(即耐用
性因素)所以供试品溶液的浓度应在保证小于最
大进样量的情况下适当设定得高些以保证该浓
度在任何试验条件下均有足够的检测灵敏度.表
1为最低检出浓度、最大进样量、供试品溶液和对
照溶液间的比例关系(进样量10µl规定杂质限度
1.0).
4 线性试验
在稳定性考察中如某杂质含量不断增加
则说明被测物降解的途径稳定、可循则有必要对
该杂质进行针对性地监控即采用该杂质对照品
(经确证结构后由人工合成获得)以外标法准确测
定.此时与含量测定相似应进行线性试验.
通常将杂质限度设定为该杂质的100浓度线性
验证范围10150(即相当于被测物测定浓度
表1 最低检出量、最大进样量、供试品溶液和对照
溶液间的比例关系
参数浓度/µg·ml
–
1
绝对量/ng相当于供试品
溶液浓度/与最低检出
浓度的倍数
最大进样量3000
最低检出浓度0.110.02
供