从克隆载体上PCR出目的基因原理

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• DNA分子克隆与PCR扩增DNA的区别T载体是克隆载体,能把目的基因片段转染到大肠杆菌扩增,但不表达.我新手弱弱的问一句为什么不直接把目的片段拿去跑PCR就行了,干嘛要用克隆载体去获得大量目的基因片段呢?
• 关于454焦磷酸测序的原理问题测序过程到底是如何进行的?我知道每有一个碱基匹配正确就会发出荧光,但我的问题如下：每个磁珠上的单克隆是同个目的基因的不同片段还是不同的目的基因,即该测序方法是能同时测序多个不同基因序列还是快速测出一个基因的序列?如果是将一个基因序列打断到不同的磁珠里,那怎样保证分别测序后各片段序列按照原基因序列顺序重新整合?该方法是否可以控制一次只结合一个碱基（如果目的序列是AAA,在T核苷酸进入时会不会一下合出3个连续碱基）?还有就是假设目的片段长为a,一个碱基进入的时间为t,那么测量整段目的片段的用时是不是就应该是4at?这真的很快吗?以上问题能答多少就答多少,
• 已知一个基因的mRNA和cDNA,我想克隆此基因,进行转染表达,但是设计的引物无法扩增出目的片段……急求!我目的片段大小为2800,载体为eGFP-N1,设计引物中,我是取了ATG开始的前20个左右的碱基,加入酶切位点和保护碱基,后面是取了去掉终止密码子的互补序列,加入酶切位点和保护碱基……（问题：1、除了酶切位点和保护碱基,还有什么需加入什么吗?2、需要在上游序列中加入KOZAK序列吗?其作用是什么?下游也需要吗?3、酶切位点的保护碱基是特定的吗?4、克隆目的基因,必须从ATG开始设计上游引物,终止密码子设计下游引物吗?可不可以从中间或者两侧设计?因为位置若固定的话很难找到合适的引物）……十分紧急,
• 问个重组质粒的电泳图和重组质粒pcr产物的电泳图的基本问题很小白,我不懂重组质粒的电泳图是如何验证重组质粒成功构建了呢,因为跑出来的大小与重组质粒应有的大小一致?还有不明白重组质粒pcr后的电泳图到底是目的基因的电泳图呢还是克隆载体的电泳图,是特异性PCR么?.实际上完全不明白为什么重组质粒pcr后又电泳一下的意义是什么.
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