关于人细胞蛋白提取的问题
问题描述：
关于人细胞蛋白提取的问题
我在做一个膜蛋白,一条链,但是由二硫键连接.我用的RIPA（强）提取的,在用抗体时,说明书上讲在reducing condition的状态下可以压出两条带.问题是用RIPA对膜蛋白提取率如何?二是,什么是reducing condition?RIPA提取的protein是什么状态?谢谢了
提蛋白做western blot 用
答
既然只是做western的就不用这么麻烦,我通常是用RIPA、PMSF、磷酸酶抑制剂（视情况加）裂解细胞离心后,收集上清,加入loading沸水煮15min,然后直接做western.
reducing condition：就是还原状态,二硫键被打开时,蛋白恢复成链状态,而不是缠绕成高级结构,用RIPA提取时,部分蛋白被还原,由于还原和非还原两种状态即跑出两条带,如果所用的抗体是结合在非缠绕部分,结果曝光即会出现两条相邻的带我提的是一种跨膜蛋白，胞外区有一个二硫键，RIPA对膜蛋白提取率怎么样？我是曝出了相邻的两条带，但是还原态和非还原态分子量会有差异吗，ripa提蛋白能不能做到都是还原态？现在曝出的条带好几条，很纠结，根本没法分析。