从突变体中克隆未知突变基因的方法?

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• 已知一个基因的mRNA和cDNA,我想克隆此基因,进行转染表达,但是设计的引物无法扩增出目的片段……急求!我目的片段大小为2800,载体为eGFP-N1,设计引物中,我是取了ATG开始的前20个左右的碱基,加入酶切位点和保护碱基,后面是取了去掉终止密码子的互补序列,加入酶切位点和保护碱基……（问题：1、除了酶切位点和保护碱基,还有什么需加入什么吗?2、需要在上游序列中加入KOZAK序列吗?其作用是什么?下游也需要吗?3、酶切位点的保护碱基是特定的吗?4、克隆目的基因,必须从ATG开始设计上游引物,终止密码子设计下游引物吗?可不可以从中间或者两侧设计?因为位置若固定的话很难找到合适的引物）……十分紧急,
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• 下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（　　）①从基因文库中获取目的基因  ②利用PCR技术扩增目的基因  ③反转录法  ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成.A. ①②③④B. ①②③C. ②①④D. ②③
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• 请帮忙翻译,It follows from Definitions 2 that A is bigger than B.
• be compliant with 和 be compliance with 的区别