western blot中,封闭液封闭完成后,需要用PBS或PBST洗涤滤膜,然后进行一抗孵育,在一抗孵育完成后为什么要清洗滤膜上的磷酸盐,磷酸盐对后续的加入二抗有什么影响?一抗孵育完成后，我是知道洗膜的，可是《分子克隆》上说要清洗掉磷酸盐与叠氮钠，清洗叠氮钠我知道为什么，可是不知道为什么要清洗掉磷酸盐，因为在网上有不少资料在洗膜过程中是不用换掉PBS的（因PBS中含有磷酸盐），可是《分子克隆》上说要在一抗孵育完成后用TBST洗滤膜，
问题描述：
western blot中,封闭液封闭完成后,需要用PBS或PBST洗涤滤膜,然后进行一抗孵育,在一抗孵育完成后为什么要清洗滤膜上的磷酸盐,磷酸盐对后续的加入二抗有什么影响?
一抗孵育完成后，我是知道洗膜的，可是《分子克隆》上说要清洗掉磷酸盐与叠氮钠，清洗叠氮钠我知道为什么，可是不知道为什么要清洗掉磷酸盐，因为在网上有不少资料在洗膜过程中是不用换掉PBS的（因PBS中含有磷酸盐），可是《分子克隆》上说要在一抗孵育完成后用TBST洗滤膜，
答
就是洗叠氮钠和非特异结合的一抗的，磷酸盐只是缓冲环境，当然有人不喜欢用PBST洗，有人用TBST洗，就是一个磷酸盐缓冲环境和Tris的缓冲环境而已，个人喜好。
答
有可能你看错了，就一般的理解，是没有必要的，TBST并不是洗磷酸盐。或者二抗是AP标记的才要洗磷酸盐。
HRP标记的二抗，就算是用PBST洗，也是可以的。因为二抗可以用PBS稀释。洗去PBS是没有意义的。
答
封闭完可直接一抗孵育 一抗完了用PBST洗三次后二抗孵育 离子浓度肯定会对抗体结合有影响啦
答
一抗孵育完了要用PBST或TBST洗掉未结合抗原的一抗，一抗不洗干净显色以后背景会很重。
答
一抗孵育完成后洗膜是为了洗掉未和膜结合的抗体,而不是磷酸盐.只有洗干净非特异性结合在膜上的一抗,加二抗时才不会因非特异结合而呈现很重的背景.至于是使用PBS(T)还是TBS(T),这要具体看你的二抗种类.PBS不适合AP系列,PBS/TBSS适合AP和HRP体系.另外,做磷酸化蛋白的WB,PBS不合适.