革兰氏染色的关键步骤是什么

实验方法
步骤
　　革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方
法是： 　　1）涂片固定。 　　2）草酸铵结晶紫染1分钟。 　　3）自来水冲
洗。 　　4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 　　5）水洗，用吸水纸吸去水分。
　　6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 　　
7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。
G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱
水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙
醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

结晶紫初染、碘液媒染、乙醇脱色、番红复染四步都很重要，关键是控制好每一步骤的时间，分分半半。

革兰氏染色四大基本步骤：
结晶紫初染
碘液媒染
乙醇脱色
沙黄复染
其中乙醇脱色是关键
因为如果脱色过度,有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性
如果脱色不够,有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性

革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染，再加媒染剂—碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫与碘形成分子量较大的复合物，然后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色，最后用番红复染。凡细胞不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者为革兰氏阳性菌，如被脱色后有染上复染剂的颜色（红色）者为革兰氏阴性菌。
一般乙醇脱色的时间为30s,如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可能被脱去颜色而被误认为是革兰氏阴性菌；相反，如果时间不够，革兰氏阴性菌未被完全脱色而被认为是革兰氏阳性菌。
染色时间一般控制在1min。