做ISSR 的PCR条件优化我想根据这几个做个正交试验 模板浓度,dNTP,引物浓度,taq酶,Mg离子浓度是不是太多了……?退火温度我用梯度PCR基本弄好了,总体积25μl,模板1μl,引物1μl,其它用的是mix跑的,我想问下上面各条件大概范围,比如模板浓度在0.5μl-3μl之间,其它的呢?另外我还想问下ISSR一般条带是多少?我看有的说平均条带在10多条左右,我试过13条引物了最多的才12条带左右多1°C热爱 你说的引物浓度这么低啊？0.2μM/L
问题描述：
做ISSR 的PCR条件优化
我想根据这几个做个正交试验 模板浓度,dNTP,引物浓度,taq酶,Mg离子浓度
是不是太多了……?
退火温度我用梯度PCR基本弄好了,总体积25μl,模板1μl,引物1μl,其它用的是mix跑的,
我想问下上面各条件大概范围,比如模板浓度在0.5μl-3μl之间,其它的呢?
另外我还想问下ISSR一般条带是多少?我看有的说平均条带在10多条左右,我试过13条引物了最多的才12条带左右
多1°C热爱
你说的引物浓度这么低啊？0.2μM/L
答
我把我本科 的实验体系给你,你参考下.
（1） 最佳DNA模板量
在PCR扩增系统中DNA模板的纯度和数量都会对结果产生影响.模板DNA抽提纯化不彻底残留苯酚,乙醇等物质将无法准确的扩增出预期结果；模板DNA用量过低会使扩增过程不完整,出现产物少,条带弱的结果；模板DNA用量过高又会出现非特异条带增多,背景弥散状[106].本实验结果表明模板量在20ng-100ng间条带都比较清晰,差异不大.从节约最优原则考虑选择20ng模板量（图3-9-a）.
（2）最佳Mg2+浓度
Mg2+浓度为2.0mmol/L时,所扩增的条带数最多,而且比较清晰,综合考虑本实验最佳Mg2+浓度定位2.0mmol/L.
（3） 最佳Taq酶浓度
在25µl的反应体系中2UTaq酶用量最优.条带清晰,且数目较多.
（4） 最佳dNTP浓度
本实验设定的5个dNTP梯度扩增结果看200μmol/L时条带最清晰选为最佳浓度（图3-9-d）.
（5） 最佳引物浓度
本实验引物浓度选取0.2μmol/L（图3-9-e）.
（6） 最佳退火温度
本实验发现反应体系退火温度为52℃时,