我想问问我加的酶切位点和保护碱基对不对
问题描述：
我想问问我加的酶切位点和保护碱基对不对
AIF-ECOR1：cg gaattc gctacaagcacgctctaacatct
AIF-BAMH1: c ggatcc cggactctgtctcactctctgat
保护碱基和酶切位点我用空格分开了,好辨认!
扩出来后准备双酶切后连接质粒PCDNA3.1
但是今天试了退火温度60.55都不行
答
EcoR I的识别序列和切割序列都没有问题,保护碱基也行.但是BamH I的保护碱基太少,这样PCR产物的2小时酶切效率只有10%,20小时酶切效率只有25%,最好能够设计“CG”为保护碱基,这样能够保证2小时及20小时酶切效率在90%以上.另外我建议你把退火温度设置在50.2摄氏度至51.9摄氏度这个范围内,当然也可以采用Touchdown方法.