如何冻存细胞

一、材料
　　（一）仪器 　　1.净化工作台 　　2.离心机 　　3.恒温水浴箱 　　4.冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 　　5.倒置相差显微镜 　　6.培养箱 　　7.液氮冰箱 　　（二）玻璃器皿 　　1.吸管（弯头、直头） 　　2.培养瓶 　　3.玻璃瓶（250ml、100ml） 　　4.废液缸 　　（三）塑料器皿 　　1.吸头 　　2.枪头 　　3.胶塞 　　4.移液管（10ml） 　　5.15ml离心管 　　6.冻存管（1～2ml） 　　（四）其他物品 　　1.微量加样枪 　　2.红血球计数板 　　3.记号笔 　　4.医用橡皮膏 　　5.移液枪 　　（五）试剂 　　1.D-Hanks液 　　2.小牛血清 　　3.培养液 　　4.双抗（青霉素、链霉素） 　　5.胰蛋白酶（0.08%） 　　6.1NHCl 　　7.7.4%NaHCO3 　　8.DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油
二、操作步骤
　　（一）细胞冻存 　　1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 　　2.取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 　　3.离心1000rpm,5min； 　　4.去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 　　5.将细胞分装入冻存管中,每管1～1.5 ml； 　　6.在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者； 　　7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时,可增至-5℃～-10℃/ 　　min；到-100℃时,则可迅速浸入液氮中.也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内.　　（二） 细胞复苏 　　1.从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化.　　2.从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀； 　　3.离心,1000rpm,5min； 　　4.弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养； 　　5.次日更换一次培养液,继续培养.
三、注意事项
　　1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞.在冻存前一天最好换一次培养液； 　　2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤； 　　3．冻存和复苏最好用新配制的培养液.