求细胞冷冻保存方法和注意事项

博凌科为生物科技-为你1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态,约为80 90 ％致密度.2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生.3、注意冷冻保护剂之品质.DMSO 应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10 ml 小体积分装,4℃ 避光保存,勿作多次解冻.Glycerol 亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存.在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性.4、冷冻保存之细胞浓度：（1）normal human fibroblast:3 x 106 cells/ml（2）hybridoma:3 x 106 cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去.（3）adherent tumor lines:7 x 106,依细胞种类而异.Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度,而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml.（4）other suspensions:10 x 106 cells/ml,human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml.5、冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败.6、冷冻方法：（1）传统方法:4℃ 10 分钟--- -20℃ 30 分钟--- -80℃ 16 - 18 小时(或隔夜)--- 液氮槽vapor phase 长期储存.（2）程序降温：利用等速降温机以1 -3℃/分钟之速度由室温降至120℃,放在液氮槽vapor phase 长期储存.适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存.7、材料：（1）生长良好之培养细胞（2）新鲜培养基（3）DMSO (Sigma D-2650)（4）无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)（5）0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)（6）血球计数盘与盖玻片（7）等速降温机(KRYO 10 Series II)8、步骤：（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形.（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中,最后浓度为5-10％,混合均匀,置于室温下待用.（3）依细胞继代培养之操作,收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率.（4）离心,去除上清液,加入适量冷冻保存溶液,使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1 ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测.（5）冷冻保存方法1:冷冻管置于4℃ 10 分钟 -20℃ 30 分钟 -80℃ 16～18 小时(或隔夜) 液氮槽vapor phase 长期储存.（6）冷冻保存方法2:冷冻管置于已设定程序之等速降温机中,再放入液氮槽中.程序为:program 7:HB CELL