各位高手请问一下Burkholderia菌是属于细菌,我可以用3'RACE方法扩增其全基因序列吗?引物怎么设计
各位高手请问一下Burkholderia菌是属于细菌,我可以用3'RACE方法扩增其全基因序列吗?引物怎么设计
谢谢你的回答,不过我现在做的是Burkholderia产的脂肪酶的全基因扩增,通过酶的分离纯化后得到N端的7个氨基酸序列,但在NCBI上比对发现同源性很低,是新酶.之前也用过兼并引物扩增PCR,但结果很不理想.介于这种情况请问我应该用什么方法调取全基因好呢?
这个比较麻烦,如果你想用RACE的方法,3'末端需要添加上像真核生物那样的polyA尾巴,而且你要克隆它的全基因序列,还要做5'RACE.
RACE技术比较适合真核生物.
如果你要克隆的基因很保守,可以去genbank查找一些与这个菌亲缘关系比较近的菌种,看它们的这个基因是不是已经有提交,如果有全基因组更好,通过设计同源引物,可以很方便的把它的这个基因克隆出来.原核生物的基因不含内含子,所以从基因组里扩增就好,原核生物的mRNA的不是很稳定.
有7个氨基酸序列用NCBI比对找到同源的序列比较困难.可以缩小范围去做比对,比如只和Burkholderia的基因或蛋白做比对（在参数选择“Choose Search Set”里的“Organism”里限定物种）.另外,如果用blastp找不到同源序列的话,不妨用tblastn去和Burkholderia的基因组或者所有细菌的核酸序列比对看看.在NCBI上有多种Burkholderia的genome序列.设定好搜索关键词去看看吧（如图）.
此外,关于Burkholderia脂肪酶的基因序列,也可以设定关键词然后查一下,把它们的蛋白序列都下载下来做一下序列比较,至少对它们的同源性,以及你得到的氨基酸序列跟它们的同源性会有一定的启示.