SDS-PAGE的操作步骤

(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A).该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方.(主要分为浓缩胶和分离胶,配方可自己上网查下)
(2) 样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩[V1] 的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液.例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液.使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品.5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015).
100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白[V2] .
(3) 上样与电泳
冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可.
为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066).
电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B).
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳.对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右.SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求,也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102).为了电泳方便起见,也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定定时时间为90－120分钟.设置定时可以避免经常发生的电泳过头.
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳.
3. 转膜(Transfer)[V3]
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33).硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用,但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开.膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤.
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,可以设定转膜电流为300-400mA,转膜时间为30-60分钟.也可以在15-20mA转膜过夜.转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102).具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短.
在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜.
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上.转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色,以观察实际的转膜效果.也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色,以观察蛋白的残留情况.
4. 封闭(Blocking)
转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液.从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景[V4] .
用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸尽洗涤液,加入Western封闭液(P0023B),在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟.对于一些背景较高的抗体[V5] ,可以4℃封闭过夜.在整个Western过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)或类似仪器,侧向摆动速度比较缓慢,而且也容易让溶液覆盖蛋白膜.
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书,按照适当比例用Western一抗稀释液(P0023A)稀释一抗.
用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时.如果一抗孵育一小时效果不佳,可以4℃缓慢摇动孵育过夜.或根据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间.
回收一抗[V6] .加入Western洗涤液(P0023C),在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟.吸尽洗涤液后,再加入洗涤液洗涤5-10分钟.共洗涤3次.如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数.
注：Western结果通常需要提供内参作为对照,通常可以选用Tubulin抗体(AT819)或Actin抗体(AA128),进行内参检测.
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书,按照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗. 二抗需根据一抗进行选择,例如,一抗是小鼠来源的IgG,则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗,如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216).碧云天有多种二抗提供.
用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时.
回收二抗.[V7] 加入Western洗涤液(P0023C),在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟.吸尽洗涤液后,再加入洗涤液洗涤5-10分钟.共洗涤3次.如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数.
7. 蛋白检测(Detection of proteins)
参考相关说明书,使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL类试剂来检测蛋白.压片可以采用专用的压片暗盒(FFC58/FFC83)进行.
洗片时可以使用X光片自动洗片机.如果没有自动洗片机,可以用显影定影试剂盒(P0019/P0020)自行配制显影液和定影液进行手工洗片.X光片推荐选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMAT BT胶片(FF057/FF081).
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵,可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)处理蛋白膜,以重复利用蛋白膜.
[V1]为什么要加缓冲液?提取的样品是等体积的么? [V2]? [V3]过程?传膜之后怎么没色? [V4]? [V5]蛋白? [V6]还能反复利用? [V7]还能反复利用?