植物叶片DNA提取失败的原因是什么,提了两次都没结果
植物叶片DNA提取失败的原因是什么,提了两次都没结果
①取鲜叶、干叶分别加入0.03 gPVP于研钵中,用液氮将研钵预冷,将除去叶脉的叶片放入研钵中,加入液氮将叶片快速研磨至粉末状,迅速转移至1.5ml离心管中,加入冰浴的CTAB缓冲液600ul,混匀,冰浴10min,在4℃、5000 r/min下离心10min,收集沉淀;③在沉淀中加入65℃预热CTAB裂解液600ul混匀,65℃水浴30~40 min,中间轻柔振荡3次;④在溶液中加入5 mol/L KAc 1 ml,混匀,冰浴20min;⑤加入600ul氯仿∶异戊醇=24∶1,轻柔颠倒混匀,乳化10min,于20℃、12 000 r/min下离心10 min,吸取上清液,转入新离心管中;⑥重复⑤1次.对以上方法所得溶液300ul分别加入60ul的3 mol/LNaAc及600ul-20℃预冷的无水乙醇,混匀,冰上沉淀30min;于室温12 000 r/min下离心10min,弃去上清液,将沉淀转入1.5ml离心管中;用75%乙醇漂洗5min,重复1次,再用无水乙醇漂洗5 min,沉淀置于室温下干燥至无酒精味;加入100μlTE溶解沉淀,进行DNA纯化或放入-20℃冰箱备用.
不知是什么植物的叶片,小量法用CATB提取显得繁琐了.看了操作步骤,觉得CATB用冰浴不太合适,因为CATB在温度低于15°C时会结晶析出；其次如果叶片中没有过多多糖,为什么要用醋酸钾.建议：小量法采用SDS法就可以,析出的D...冰浴的是缓冲液，里面没有CTAB，提取的是草本科植物，因为富含多糖等杂志，醋酸甲是想沉淀蛋白质跟多糖的，操作问题应该不大，裂解液才有家CTAB的，我想问下，加入裂解液和缓冲液的时候，震荡时间会不会影响很大，还有氯仿/异戊醇不按等体积加，就是试管只有1.5毫升，所以少加了一百微升左右，影响大不大？震荡时间不会有太大影响，即使剧烈震荡或震荡时间过长，也会有主带和弥散带，不至于什么也没有，氯仿/异戊醇加入量少可能会有影响。既然是多糖植物，CTAB/KAC/PVP配合使用应该没有问题，但我总觉的KAC浓度有点高，而且酶清除不彻底，要不你换个10mL管子提，样品和提取液用量相应放大，第四步，加入KAC后，终浓度为1mol/L，室温轻轻混匀，不要冰浴，接着加入等体积酚仿，离心取上清后，加入氯仿∶异戊醇再提一次。后面的步骤没看出有什么问题。谢谢啦，可以试一下