简述PCR技术的基本原理及反应条件的选择

PCR技术概论
http://shiyan.ebioe.com/PCRPE-CetusMullisTaqDNA_3.htm
(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术. 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定.过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成.PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑.
PCR技术简史
PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”.
PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应.其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间.
PCR的改进与完善最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段,其缺点是：①Klenow酶不耐高温, 90℃会变性失活,每次循环都要重新加.②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一.此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难.这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视.
1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段.但每循环一次,仍需加入新酶.
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶. 此酶具有以下特点：①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%,在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%,在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%.②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶.③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度(2.0Kb).由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高.为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别,将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase).此酶的发现使PCR广泛的被应用.
PCR技术的基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.
. 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升.反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算.Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数.平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值. 反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA 片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期, 即出现“停滞效应” ,这种效应称数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素.大多数情况下,平台期的到来是不可避免的.
PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分.短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间,是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中, 以两条互补的DNA为模板,引物是从3'端开始延伸, 其5'端是固定的,3' 端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”.进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合.引物在与新链结合时, 由于新链模板的5'端序列是固定的, 这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点, 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”.不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加, 而“长产物片段”则以算术倍数增加, 几乎可以忽略不计, 这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用.
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、、模板和2+
： 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增.
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： ,常用为左右.
②引物扩增跨度： 以为宜,特定条件下可扩增长至的片段.
③引物碱基：含量以为宜,太少扩增效果不佳,过多易出现非特异条带.最好随机分布,避免个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带.
⑤引物端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败.
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处.
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性.
引物量： 每条引物的浓度.～或～,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会.
目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反应约需酶量.指总反应体积为时,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少.
的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性.溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以或.的缓冲液将其调节到.～.,小量分装, ℃冰冻保存.多次冻融会使降解.在PCR反应中,应为～,尤其是注意种的浓度要相等等摩尔配制,如其中任何一种浓度不同于其它几种时偏高或偏低,就会引起错配.浓度过低又会降低PCR产物的产量.能与2+结合,使游离的2+浓度降低.
模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用和蛋白酶来消化处理标本.的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸.提取的核酸即可作为模板用于PCR反应.一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增.模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶法,要防止降解.
2+2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种浓度为时,2+浓度为.～.为宜.浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少.
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数.
： 基于PCR原理三步骤而设置变性退火延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在～℃变性,再迅速冷却至～℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至～℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因长度为～时可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用℃变性,℃左右退火与延伸此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性.
①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因.一般情况下,℃～℃足以使模板DNA变性,若低于℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响.此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败.
②退火复性温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素.变性后温度快速冷却至℃～℃,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度.对于个核苷酸,含量约的引物,℃为选择最适退火温度的起点较为理想.引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性.复性时间一般为～,足以使引物与模板之间完全结合.
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时, DNA合成几乎不能进行.
PCR反应的延伸温度一般选择在～℃之间,常用温度为℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合.PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般以内的DNA片段,延伸时间是足够 的.～的靶序列需～；扩增需延伸至.延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现.对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些.
循环次数决定PCR扩增程度.PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度.一般的循环次数选在～次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多.