有哪些条件可影响PCR反应

PCR反应条件为温度、时间和循环次数.
　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性).
　　①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因.一般情况下,93℃～94℃min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响.此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败.
　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素.变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度.对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
　　Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
　　复性温度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性.复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合.
　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　高于90℃时, DNA合成几乎不能进行.
　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合.PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的.3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min.延伸进间过长会导致PCR反应条件为温度、时间和循环次数.
　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性).
　　①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因.一般情况下,93℃～94℃min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响.此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败.
　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素.变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度.对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
　　Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
　　复性温度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性.复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合.
　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　高于90℃时, DNA合成几乎不能进行.
　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合.PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的.3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min.延伸进间过长会导致PCR反应条件为温度、时间和循环次数.
　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性).
　　①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因.一般情况下,93℃～94℃min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响.此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败.
　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素.变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度.对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
　　Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
　　复性温度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性.复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合.
　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　高于90℃时, DNA合成几乎不能进行.
　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合.PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的.3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min.延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现.对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些.