TTC法测定根系活力的标准方程,

物根系是活跃的吸收器官和合成器官,根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平.本实验练习测定根系活力的方法,为植物营养研究提供依据.
一、原理
氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80 mV的氧化还原色素,溶于水中成为无色溶液,但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲 （TTF）,如下式：
生成的三苯甲 （TTF）比较稳定,不会被空气中的氧自动氧化,所以TTC被广泛用作酶试验的氢受体,植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强,而被丙二酸、碘乙酸所抑制.所以TTC还原量能表示脱氢酶活性,并作为根系活力的指标.
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
水培或砂培小麦、玉米等植物根系.
（二）试剂
1.乙酸乙酯（分析纯）.
2.次硫酸钠（Na2S2O4,分析纯）,粉末.
3.1％TTC溶液：准确称取TTC 1.0 g,溶于少量水中,定容到100 mL.用时稀释至需要的浓度.
4.磷酸缓冲液（1/15 mol/L,pH7.0）.
5.1 mol/L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55 mL,边搅拌边加入盛有500 mL蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000 mL.
6.0.4 mol/L琥珀酸：称取琥珀酸4.72 g,溶于水中,定容至100 mL即成.
（三）仪器设备
小烧杯3个,研钵1个,移液管：0.5 mL 1支、10 mL 1支、5 mL 3支,刻度试管6支,分光光度计,分析天平（感量0.1 mg）,电子顶载天平（感量0.1 g）,温箱,试管架,药勺,石英砂适量,滤纸.
三、实验步骤
1.定性测定
（1）配制反应液 把1％ TTC溶液、0.4 mol／L的琥珀酸和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合.
（2）把根仔细洗净,把地上部分从茎基部切除.将根放入三角瓶中,倒入反应液,以浸没根为度,置37℃左右暗处放1～3 h,以观察着色情况,新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色,表明该处有脱氢酶存在.
2.定量测定
（1）TTC标准曲线的制作 取0.4％ TTC溶液0.2 mL放入大试管中,加9.8 mL乙酸乙酯,再加少许Na2S2O4粉末摇匀,则立即产生红色的TTF.此溶液浓度为每毫升含有TTF 80 µg.分别取此溶液0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL置10 mL刻度试管中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含TTF 20 µg、40 µg、80 µg、120 µg、160 µg的系列标准溶液,以乙酸乙酯作参比,在485 nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线.
（2）称取根尖样品0.5 g,放入小烧杯中,加入0.4％ TTC溶液和磷酸缓冲液（pH7.0）各5 mL,使根充分浸没在溶液内,在37℃下暗保温1～2 h,此后立即加入1 mol/L硫酸2 mL,以停止反应.（与此同时做一空白实验,先加硫酸,再加根样品,37℃下暗保温后不加硫酸,其溶液浓度、操作步骤同上）.
（3）把根取出,用滤纸吸干水分,放入研钵中,加乙酸乙酯3～4 mL,充分研磨,以提出TTF.把红色提取液移入刻度试管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2～3次,皆移入刻度试管,最后加乙酸乙酯使总量为10 mL,用分光光度计在波长485 nm下比色,以空白试验作参比测出吸光度,查标准曲线,即可求出TTC还原量.
四、结果计算
根系活力= C/(1000*W*h) [mg TTF/（g•h）]
式中：C——四氮唑还原量,μg.
W——根重,g.
h——时间,h.