纸层析实验的实验步骤及现象

氨基酸的纸层析 一、 实验目的 1.了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法.2.学习纸层析法的操作技术,分析未知样品氨基酸的成分.二、 实验原理 用滤纸为支持物进行层析的方法,称为纸层析法,它是分配层析法的一种.纸层析所用的展层溶剂大多是由水饱和的有机溶剂组成.滤纸纤维的—OH 基的亲水性基团,可吸附有机溶剂中的水作为固定相,有机溶剂作为流动相,它沿滤纸自下向上移动,称为上行层析；反之,使有机溶剂自上而下移动,称为下行层析.将样品点在滤纸上进行展层,样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配,由于它们各自的分配系数不同,故在流动相中移动速率不等,从而使不同的氨基酸得到分离和提纯.纸层析法主要是依据混合组分对二相分配系数的差异进行分离,但亦存在着某种程度的吸附作用和离子交换现象.氨基酸经层析在滤纸上形成距原点不等的层析点,氨基酸在滤纸上的移动速率用Rf 表示.Rf = 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 只要实验条件(如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等)不变,Rf 值是常数,因此可做定性分析参考.如果溶质中氨基酸组分较多或其中某些组分的Rf 值相同或近似,用单向层析不宜将它们分开,为此可进行双向层析,在第一溶剂展开后将滤纸转动90度,以第一次展层所得的层析点为原点,再用另一种溶剂展层,即可达到分离目的.由于氨基酸无色,可利用茚三酮反应使氨基酸层析点显色,从而定性和定量.三、仪器和试剂 仪器 层析滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、培养皿、猴头喷雾器、微量加样器或毛细管、吹风机一个、直 尺、铅笔等.试剂 1.混合氨基酸溶液(水解后的氨基酸干粉) 甘氨酸溶液：50mg 甘氨酸溶于5mL 水中.蛋氨酸溶液：25mg 蛋氨酸溶于5mL 水中.亮氨酸溶液：25mg 亮氨酸溶于5mL 水中.氨基酸混合液：甘氨酸50mg,亮氨酸25mg,蛋氨酸25mg 共溶于5mL 水中.2.展层溶剂 碱相溶剂：正丁醇∶12%氨水∶95%乙醇 = 13∶13∶13(V/V) 酸相溶剂：正丁醇∶80%甲酸∶水 = 15∶3∶2(V/V),摇匀后放置半天以上,取上清液备用.3.显色贮备液：0.4mol/L 茚三酮—异丙醇∶甲酸∶水=20∶1∶5.4.0.1%硫酸铜：75%乙醇=2∶38,临用前按比例混合.四、实验步骤 (1)标准氨基酸单向上行层析法 1.画基线 戴上指套或橡皮手套,在长约20cm、宽约17cm 滤纸上,距短边2.5cm 处,用铅笔画一条线,即为基线.2.点样 在原线上,从距纸的长边4cm处开始,每隔3cm 用微量注射器或毛细管依次分别点上甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和混合氨基酸溶液.点样点干后可重复点加1～2次.每一点的直径不超过2mm,点样量以每种氨基酸含5～20ug 为宜.3.展层 将点好样的滤纸卷成筒形,滤纸两边不相接触,用线固定好,将原线的下端浸入盛有溶剂的培养皿中,不需平衡可立即展层.展层剂为酸性溶剂系统,在展层溶剂中加入显色贮备液(每10mL 展层剂加0.0.5mL 的显色贮备液)进行展层,基线必须保持在液面之上,以免氨基酸与溶剂直接接触.盖好层析缸,当溶剂前沿距纸端2cm 时(大约3h),取出滤纸.4.显色 滤纸取出后,吹干或在80℃左右烘箱内烘3～5min,即出现紫红色的氨基酸层析 斑点.用铅笔划下层析斑点,可进行定性、定量测定.(2)混合氨基酸双向上行纸层析法 1.滤纸准备 将滤纸裁成约28cm2的正方形,在距滤纸相邻两边各2cm 处的交点上,用铅笔划下一点,做为原点.2.点样 取混合氨基酸溶液(5mg/mL)10～15μL,分别点在原点上.3.展层与显色 将点好样的滤纸卷成半筒形,立在培养皿中,原点应在下端.取少量12%的氨水与小烧杯中,盖好层析缸,平衡过夜.次日,取出氨水,加适量碱相溶剂(第一向)与培养皿中,盖好层析缸,上行展层,当溶剂前沿距滤纸上端1～2cm 时,取出滤纸,冷风吹干.将滤纸转90o,再卷成半筒形,竖立在干净培养皿中,并于小烧杯中至少量酸相溶剂,盖好层析缸,平衡过夜,次日将加显色剂的酸性溶剂(每10mL 展层剂加0.0.5mL 的显色贮备液)倾入培养皿中,进行第2向展层.展层毕,取出滤纸,用热风吹干,蓝紫色斑点即显现.五、计算 单向层析的Rf 值,按 “Rf = 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离”计量后计算.双向层析Rf 值,由两个数值组成,在第一向计量一次,第二向计量一次,分别与已知的氨基酸在酸碱系统的Rf 值对比,即可初步决定它为何种氨基酸的斑点,将它剪下,在同一张纸剪下一块大小相同的空白纸作为对照,用硫酸铜—乙醇溶液洗脱,用722型分光光度计测定其吸光度,在标准曲线上查出氨基酸的含量.