细胞污染问题

黑胶虫
1、 黑胶虫概况：
在细胞培养的时候,有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动,小黑点有时呈点状,有时呈小的片状,运动形式为在原地振动（类似布朗运动）,这种小黑点既不是细菌、霉菌,也不是支原体（我们曾经请周守长用血平板培养过,没有菌落出现）,目前业内人士称其为“黑胶虫”.
黑胶虫到底是否为生物?这个一直是业内人士的疑惑.黑胶虫一般是存在血清里的,而血清通常是经过0.1μm滤膜过滤的,所以血清里不可能存在细菌、霉菌及支原体等微生物.如果说黑胶虫不是生物,它会不断增多,达到一定数量时会与细胞竞争性生长,与细胞竞争培养基中的营养,从而使得细胞营养不足而死亡.
不管对于黑胶虫的争论如何,但有几个是目前大家公认的：
① 与细胞竞争性生长,对细胞生长有不利影响.
② “黑胶虫”会增殖,增殖多时,视野下一大片都为“黑胶虫”.
③ “黑胶虫”与血清有关,与血清质量有很大关系.
2、目前对“黑胶虫”的定论：有2种解释：
第一, 黑胶虫为生物.它是小于细菌的生物,直径小于0.1μm,大多国外血清中多见,可能是国外牛血清中含有的某种原虫.只要它是生物,那么在培养基中一定会对细胞有影响.
第二, 黑胶虫不是生物.国内的血清中,通常灭活之后都会有絮状沉淀出现,而黑胶虫出现时,所使用的血清被反复冻融过多次.所以推测,所谓的“黑胶虫”其实就是血清中的某些蛋白成分的物质,经过灭活之后丧失活性,在培养基中,镜检见到的运动其实是这些物质在溶液中做“布朗运动”.随着细胞消耗培养基,这些物质越来越多,最后细胞所用的营养消耗完,细胞容易死亡.
3、对于“黑胶虫”的处理方法：
首先,血清买回来灭活前冻融应逐级冻融,即按照-20℃——4℃完全融化后,再置入水浴中,与室温一起升高到56度,这样的目的是避免温度骤变,导致血清中的营养物质丧失活性.
第二,血清灭活后分装保存.按照每次用血清的量分装,尽量减少血清冻融的次数.分装时注意无菌.
第三,细胞培养时血清浓度稍大一些.通常细胞培养血清浓度为10%-15%,但如果血清冻融次数过多,那营养物质丧失活性,按15%的浓度配制事实上达不到15%的营养成分,故培养基配置时一般用18%-20%的血清.
这种黑胶虫,在国外称其为- 纳米细菌,现将我看到的一些资料转述如下,希望对大家有所帮助：
1.纳米细菌的发现
芬兰的一个科学家Ciftcioglu et al 在其细胞培养过程中, 发现在胎牛血清中存在一种直径50-500 nm的微粒; 这种颗粒物对伽玛射线具有很强的耐受性; 针对包括支原体在内的所有已知微生物的特异性检测实验均为阴性; 这种颗粒物在血琼脂培养基以及支原体培养基中无法生长, 通常的细菌染色方法难以着色. 因此, Kajander判定这是一种新的微生物, 根据其体型微小并且栖息在血液中的特点, 将其命名为Nanobacterium sanguineum, 简称Nanobacteria, 中文译名纳米细菌, 并将菌种保存于德国微生物存储中心 (DSM No: 5819-5821, the GermanCollection of Micro-organisms, Braunschweig, Germany).
2 纳米细菌的生物学特性
2.1 纳米细菌——哺乳动物体内最小的细菌 细胞培养时所使用的血清通常采用过滤法达到无菌的目的, 通常采用直径0.1 μm的滤膜过滤除菌. Kajander研究发现, 0.1 μm
的滤膜过滤并不能有效地清除血清中的纳米细菌, 但是血清经过0.05 μm的滤膜过滤则能有效清除纳米细菌污染. 细胞培养条件下的纳米细菌经过0.2 μm的滤膜过滤后约有3%的纳米细菌可以通过滤膜, 而在加压过滤的情况下, 约有50%的纳米细菌可以通过0.2 μm的滤膜. 刚刚经过过滤的纳米细菌在相差显微镜下无法发现, 但在不含血清添加剂的细胞培养液中培养24 h后, 即可以用相差显微镜观测到. 电子显微镜观察显示, 纳米细菌的平均直径为200 nm, 而子代纳米细菌的最小直径仅50 nm. 传统的观点认为, 只有当细胞直径在不低于140 nm时, 才能维持其最基本的新陈代谢. Kajander认为, 纳米细菌可能是地球形成早期、在原始大气条件下的一种最原始的生命形式, 因此不能用衡量已经经过几十亿年进化的生命形式的观点去衡量这种古老的生命形式, 并且推测, 纳米细菌遭受不良因素的侵害后可以形成许多的体形微小的碎片, 并将其释放到环境中, 每一个碎片都可能携带部分遗传信息, 在特定条件下, 这些"基本"颗粒聚集在一起形成群落, 当足够数量的"基本"颗粒提供完整的遗传信息时, 则可以形成新的纳米细菌.
2.2 纳米细菌缓慢的增殖周期
微生物学家通常是通过对某种微生物进行培养, 进而了解该种微生物的特性. 然而, 并非每种微生物都是可以在实验室中进行培养的,主要原因在于这些微生物的培养条件我们并不清楚, 其生存环境以及是否与其他微生物存在共生关系我们并不十分了解. 纳米细菌就是一种对生长环境要求非常苛刻的微生物, 其新陈代谢率极为缓慢, 仅为普通细菌的1/10 000. 研究发现, 纳米细菌主要利用环境中的氨基酸而不是葡萄糖来提供能量, 谷氨酰胺、天冬酰胺以及精氨酸均可被其利用. 在37 ℃有50-10 mL/L的二氧化碳及900-950 mL/L的空气存在的潮湿环境下, 并且在含有100 mL/L胎牛血清和适量谷氨酰胺的pH值7.4的细胞培养基中, 纳米细菌能够缓慢生长, 平均倍增时间为3 d,而在无血清的细胞培养基中, 其增殖速度变慢, 细菌倍增时间可延长至5-6 d, 在添加适量促纳米细菌生长因子BGF(一种杆菌培养上清的超滤液)或N3(纳米细菌培养上清的超滤液)的条件下, 其增殖速度加快, 倍增时间可缩短至0.6-1 d. 在有促纳米细菌生长因子BGF存在的条件下, 纳米细菌甚至可以在固体培养基中生长, 并形成直径l mm大小的细菌集落.
2.3 纳米细菌独特的生物矿化现象
当在含血清的培养基中培养的纳米细菌被转移至不含血清的培养基中继续培养时 (DMEM或RPMI-1640), 在1 a之内就可以观察到纳米细菌出现贴壁现象, 在1 wk之内, 就可以在纳米细菌的周围形成几微米厚的生物被膜 (biofilm), 并且紧紧贴附于培养瓶底部, 而纳米细菌栖息其中(这与在含血清培养基中培养的纳米细菌的形态明显不同), 此时其大小接近于一个酵母细胞, 2-3 wk以后, 由于生物被膜的增厚, 其直径已近似于一个红细胞的大小. 用EDX法对这种生物被膜的化学组成进行分析, 显示其钙磷的峰值与羟基磷灰石极其相似, 电子显微镜观察以及傅立叶转换红外频谱(fourier transform IR spectroscopy, FTIR)分析显示其主要成分为碳酸羟基磷灰石(carbonate hydroxyapatite), 而且,不论在有无血清作为添加剂的情况下, 都可以见到这种被羟基磷灰石包绕的纳米细菌, 这种情况甚至可以在处于分裂期的纳米细菌中见到. 纳米细菌并不产生尿激酶和碱性磷酸酶, 并且即便经过长达数周的培养, 其培养基的pH值也不会出现明显的变化, 一直稳定在7.4左右, 这表明在纳米细菌细胞膜表面所生成的羟基磷灰石结晶是源自于生物大分子的, 即生物矿化现象, 而并非是由于pH值改变所导致的简单的物理结晶现象.纳米细菌利用培养体系中的钙、磷合成羟基磷灰石作为其生物被膜的主要成分, 这种生物矿化过程受到生长环境中某些因素的调控, 从而使其呈现不同的外观, 如羟基磷灰石形、细菌被膜形、沙粒形、结石形和类似肿瘤的外形. （这也许就是国内的一些研究者们认为其是一些磷酸盐类的无机物的部分原因吧!）.在含有新鲜血清的培养基中纳米细菌的生物矿化现象程度较轻微, 这是由于血清中含有强效羟基磷灰石合成抑制因子, 骨钙素 (osteocalcin) 和胎球蛋白(fetuin), 由于这些抑制蛋白的存在, 所以在有血清存在的情况下, 纳米细菌的生物矿化作用受到明显抑制. 当血清浓度降低时, 纳米细菌的生物矿化现象增强, 在不含血清的培养体系中, 生物矿化现象剧烈而迅速. 尽管改良的Loeffler固体培养基中含有750 mL/L血清成分, 但血清蛋白成分在灭菌过程中受到破坏, 所以在此培养基中的纳米细菌的矿化作用并不受抑制, 在此培养基中生长的纳米细菌其菌落直径可达1-5 mm. 另外, 当有乙二胺四乙酸(EDTA)存在时, 纳米细菌的生物现象会受到明显的抑制.由于矿化生物被膜的保护作用以及极其缓慢的新陈代谢率, 使纳米细菌能够耐受各种不利的物理条件和化学损伤因素以及多种抗生素的打击.
2.4纳米细菌的检测方法 由于纳米细菌在标准微生物培养基中无法生长, 并且即便是在最适宜其生长的细胞培养环境中, 纳米细菌的生长也极为缓慢, 其新陈代谢率仅为普通细菌的万分之一, 这使得许多基于检测细菌新陈代谢的微生物学方法无法检测纳米细菌的存在. 由于纳米细菌难以用传统的火焰法和乙醇法固定, 并且大多数染料无法穿透其细胞壁, 而且不能用普通显微镜对其进行观察, 因此常规的细菌学染色法并不能检测到纳米细菌的存在. 通过Kajander et al 的研究, 发现70℃干烤10 min, 可以将其有效固定; 另外, 用茜素红S、刚果红以及硝酸银染料可以使纳米细菌着色; 而培养状态下的纳米细菌可以在放大400倍的相差显微镜下清晰地观察其生长情况; 用DNA荧光染料 (Dapi或Hoechst) 按普通细菌DNA染色的条件对纳米细菌DNA进行染色均不成功, 而当按照线粒体DNA以及病毒DNA染色条件, 对纳米细菌DNA进行染色时, 荧光显微镜下可以观察到特征性的荧光; 用纳米细菌特异性抗体进行荧光染色也可以清晰地显示纳米细菌的存在; 利用电子显微镜对经过负染的纳米细菌进行观察, 可以清晰的显示80-350 nm大小、单独或聚集成簇的纳米细菌以及其表面的生物被膜(biofilm)结构; 而用透射电镜对纳米细菌的超薄切片进行观察, 可以清晰的显示其内部结构.
可以发现如下的特点：
（1） 与细胞共生,细胞长的好或密度大的话,小黑点就少,反之则 多；
（2） 对抗生素无效；
（3） 可能通过培养箱空气进行污染；
（4） 单用培养液及血清培养没发现问题.
（5） 换掖冲洗后也无效.
以下是论坛里我找来的相关帖子内容
“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物,“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认.
“黑胶虫”可寄生于动物细胞,也可以生存于培养基中,依靠细胞和培养基中的营养为生,并随细胞传代而传代.“黑胶虫”与细胞竞争性生长,开始时对细胞并没有什么影响,但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候, 细胞生长就会受到影响直至死亡,严重影响了科研活动的开展和进行.所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断,尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡.
目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物,增殖缓慢但对细胞有损害,数量达到一定程度可引起细胞死亡,其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的.该污染在全世界细胞实验室中普遍存在,解决该问题是一个世界性难题
关于是什么的问题的讨论
A. 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）
B. 据说这是黑胶虫,又有人说是原生动物,好象也没个统一的说法
C. 据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫,似乎和草履虫和变形虫有类似之处,然而由于课题经费不够而不能继续进行下去.
D. 有人说是纳米级的细菌
其他的特点
（1）形态上有些像细菌,直径约在0.5~1微米,
（2） 在400X倒置显微镜小,有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）.
（3） 细胞内好像也有存在,
（4） 但并不引起培养液混浊
（5） 时间稍长,细胞状态明显恶化,并最后死亡
大家的处理：
1.换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）.
2.如果是贴壁细胞的话,可用无菌的PBS洗几次,可一定程度上缓解.若是悬浮的话,就不太好处理拉,可以向其中少加一点滋养细胞（从小鼠腹腔内取的巨噬细胞,这种细胞不分裂,过一阵就死掉了,做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道）.加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效!还有就是实验环境要注意好,保持细胞间整个环境的洁净度.
3.换用进口的一次性塑料培养瓶.
4.建议清理无菌室所有物品,重新灭菌,用KMnO4熏蒸,按首次使用无菌室做,细胞重新复苏,.
5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打,冲洗干净后再加入培养液,坚持天天洗,传代时加生理盐水再离心一次,接种密度稍大一些,一段时间后,虫子就会大大减少,对细胞的生长也不会有大的影响.
6.有材料称minocycline具有一定的作用,可以和换液结合起来使用.