（Bradford法）如何测定蛋白浓度?

考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度
1、试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤.最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇,8.5%（W/V）H3PO4.
（2）标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白,根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液.
2.器材：\x0b（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器
3、标准曲线的制作
试管编号\x050\x051\x052\x053\x054\x055\x056
100ug/ml标准蛋白（ml）\x050.0\x050.1\x050.2\x050.3\x050.4\x050.5\x050.6
0.15mol/L NaCl （ml）\x051\x050.9\x050.8\x050.7\x050.6\x050.5\x050.4
考马斯亮蓝试剂 （ml）\x055\x055\x055\x055\x055\x055\x055
摇匀,1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色\x05\x05\x05\x05\x05\x05\x05
A595nm\x05\x05\x05\x05\x05\x05\x05
以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug）,在坐标轴上绘制标准曲线.
4、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复）,加入合适浓度的待测样品,使其测定值在标准曲线的范围内,测定方法同上,由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量.
注意事项：
1、 如果要求严格,最好在试剂加入后的5~20min内测定光 吸收,因为这段时间内颜色是最稳定的.
2、 若选择在旋涡混合器上混合,注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除.