如何从土壤中分离得到一株对链霉素有抗性的芽孢杆菌

菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开,并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选,进而得到所需微生物的过程.菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用.工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株,二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别. ? {cF'RB.
在实验工作中,为使筛选达到事半功倍的效果,总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选： 4jis\W}%L3
（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株,从中筛选所需菌株. ^\x155u}\x13 \x1b\x11\x10
（2）由自然界采集样品,如土壤、水、动植物体等,从中进行分离筛选. O|%>\x07放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103）,其中放线菌和霉菌指其孢子数.但各种微生物由于生理特性不同,在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化.因此,在分离菌株前要根据分离筛选的目的,到相应的环境和地区去采集样品. M*8Ef^-U`t
（一）根据土壤特点 8_8 R$ =\x1aV
1．土壤有机质含量和通气状况 &'c1"%*%8>
一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富,营养充足,且土壤成团粒结构,通气饱水性能好,因而,微生物生长旺盛,数量多,尤其适合于细菌、放线菌生长.山坡上的森林土,植被厚,枯枝落叶多,有机质丰富,且阴暗潮湿,适合霉菌、酵母菌生长繁殖,微生物数量相应也比较少. VC\x08Ng\x15`6!x
从土层的纵剖面看,1～5cm的表层土由于阳光照射,蒸发量大,水分少,且有紫外线的杀菌作用,因而微生物数量比5～25cm土层少；25cm以下土层则因土质紧密,空气量不足,养分与水分缺乏,含菌量也逐步减少.因此,采土样最好的土层是5～25cm.一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个,并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到.如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等.但总的说来酵母菌分布土层最浅,约5～10cm,霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层. \@GA\x17;~x.b
2.土壤酸碱度和植被状况 -fT\x18]}T\x146=
土壤酸碱度会影响微生物种类的分布.偏碱的土壤（pH7.0～7.5）环境,适合于细菌、放线菌生长.反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下,霉菌、酵母菌生长旺盛.由于植物根部的分泌物有所不同,因此,植被对微生物分布也有一定的影响.如番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌.葡萄或其他果树在果实成熟时,其根部附近土壤中酵母菌数量增多.豆科植物的植被下,根瘤菌数量比其他植被下占优势. m\x11:\x15)v>vu
3．地理条件 bh3}[O,L A
南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多,特别是热带和亚热带地区的土壤.许多工业微生物菌种,如抗生素产生菌,尤其是霉菌、酵母菌,大多从南方土壤中筛选出来.原因是南方温度高,温暖季节长,雨水多,相对湿度高,植物种类多,植被覆盖面大,土壤有机质丰富,造成得天独厚的微生物生长环境. +0;6\x01.PK\x03\x04
4．季节条件 75jq+O_:\x1e
不同季节微生物数量有明显的变化,冬季温度低,气候干燥,微生物生长缓慢,数量最少.到了春天随着气温的升高,微生物生长旺盛,数量逐渐增加.但就南方来说,春季往往雨水多,土壤含水量高,通气不良,即使有微生物所需的温度、湿度,也不利于其生长繁殖.随后经过夏季到秋季,约有7～10个月处在较高的温度和丰富的植被下,土壤中微生物数量比任何时候都多,因此,秋季采土样最为理想. \x08/3L\x061U\x07n*
（二）采样方法 z\x01Vd2kuI&?
用取样铲,将表层5cm左右的浮土除去,取5～25处的土样10～25,装入事先准备好的塑料袋内扎好.北方土壤干燥,可在10～30处取样.给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件.一般样品取回后应马上分离,以免微生物死亡.但有时样品较多,或到外地取样,路途遥远,难以做到及时分离,则可事先用选择性培养基做好试管斜面,随身带走.到一处将取好的土样混匀,取3～4撒到试管斜面上,这样可避免菌株因不能及时分离而死亡. &Op, ?\ \x1c
二．根据微生物生理特点采样 w\x1cbyY?\x1e\x1ftH
1.根据微生物营养类型 %r=uS.+hrF
每种微生物对碳\氮源的需求不一样,分布也有差异.研究表明,微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性.如森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等,富含纤维素,适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长；在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中,由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在,因而,在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所,容易分离到产生蛋白酶、糖化酶的菌株.若要筛选以糖质为原料的酵母菌,通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样.在筛选果胶酶产生菌时,由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有较多的果胶,因此,从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好.若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物,从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品,容易得到满意的结果.在油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株.Hartman等人曾从乙烯氯化物的工厂附近分离到一株以乙烯氯化物为碳源和能源的分枝杆菌.含1%乙烯氯化物的空气通过该菌培养可除去93%的毒性.也有人从含油污泥中筛选出能以20#机械润滑油为惟一碳源的3株石油降解菌菌株,分别为动胶菌属（Zoogloea sp.）、氮单胞菌属（Azomonas sp.）和假单胞菌属（Pseudomonas sp.）.当然,也可将一种需要降解的物质作为样品中微生物的惟一碳源或氮源进行富集,然后分离筛选. \x1fX\x14\x0e2}\i5{
此外,不少微生物对碳源的利用是不完全专一的,如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉或其他糖类物质获得能源而生长.以石油等碳氢化合物为碳源的油田微生物,也可以利用一些糖类为碳源.具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他样品中也会存在.不过数量较少. \\x15 Ex\x0eM.T
2.根据微生物的生理特性 w-C\x11 ~ Ik
在筛选一些具有特殊性质的微生物时,需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样.如筛选高温酶产生菌时,通常到温度较高的南方,或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方,如南北极地区、冰窖、深海中采样；分离耐压菌则通常到海洋底部采样.因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压,如从海中筛到一株水活微球菌（Micrococcus aquivivus）,它能在600个大气压下生长.分离耐高渗透压酵母菌时,由于其偏爱糖分高、酸性的环境,一般在土壤中分布很少,因此,通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样.如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌. \x0eAE={P*\x11g
三、特殊环境下采样 @\x08{i\x07\x05ws@.
1．局部环境条件的影响 \x03jr\x15\x02 bEJ.
值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综合因素的影响之外,还要受局部环境条件的影响.如北方气候寒冷,年平均温度低,高温微生物相对较少.但在该地区的温泉或堆肥中,却会出现为数众多的高温微生物.氧气充足的土层中按理只适合于好氧菌生长,实际上也有一些嫌气菌生活,原因是好气菌生长繁殖消耗了土层中大量氧气,为嫌气菌创造了局部生长的有利环境,故一般土壤中也能分离到嫌气菌. X/ gI\x08\x14H/
海洋对于微生物来说是一个特殊的局部环境,尽管许多微生物也是经河水、污水、雨水或尘埃等途径而来,但由于海洋独特的高盐度、高压力、低温及光照条件,使海洋微生物具备特殊的生理活性,相应也产生了一些不同于陆地来源的特殊产物.前苏联学者发现,20%～50%的海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物.此外,美国马里兰大学也曾从海绵体内的共生或共栖的细菌中分离到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物质.日本发现深海鱼类肠道内的嗜压古细菌,80%以上的菌株可以生产EPA 和DHA,最高产量可达36%和24%.笔者从鳕鱼肠道中分离到一株pj20细菌,产EPA14.78mg/L,在15℃培养时EPA占脂肪酸的12.7%.日本也从海洋Thraustochvtrium aureum中筛选到一株产DNA达290mg/L的菌株.从海洋中采样时,可参考其中不同种类微生物的分布规律：表层多为好气异养菌,底层由于有机质丰富,硫化氢含量高,厌气性腐败菌和硫酸盐还原菌较多,两层中则多为紫硫菌. \x14u\x13_;*\x06Ay\x17
具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中.如得克萨斯州中南部的一个岩洞中存在着大量嗜碱性的,能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物,其原因是这里生活这2000万只蝙蝠,它们每晚吃钓5万lb（磅）昆虫,其排泄物造成了洞内0m深的丰富营养层,这种特殊的环境对该种微生物起了选择和富集的作用.还有人从侵蚀木船的一种蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物.从考拉(Koala)熊肠中也曾分离到萜烯分解酶的产生菌,这可能因为考拉专吃含有高萜烯的桉树类植物,给该种微生物创造了一个适宜的生长环境.美国从用硝酸处理过的花生壳中分离到一株节杆菌,该菌以木质素为唯一碳源,它对处理过的花生壳的消化率可达到63%,再加入酿酒酵母使其蛋白质含量达到13.6%,可作为牛、猪、鸡饲料的添加剂. |NJe4lw+\x19?
2．极端环境条件的影响 MqGF\x16~h|+
微生物一般在中温、中性pH条件下生长.但在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下,也有少数微生物存在,这类微生物被称为极端微生物.生活所处的特殊环境,导致它们具有不同与一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理机能,因而在冶金、采矿及生产特殊酶制剂方面有着巨大的应用价值. Z.a\x1em^Q^Y!
嗜冷菌（thermophiles）的最适生长温度为15℃,在0℃也可生长繁殖,最高温度不超过20℃.主要分布于寒冷的环境中,如南北两极地区、冰窟、高山、深海和土壤等低温环境中.这类微生物在低温发酵时可生产许多风味食品且可节约能源及减少中温菌的污染.最适生长pH在8.0以上,通常在pH9～10之间的微生物,称之为嗜碱菌（alkaliphiles）.大量不同类型的嗜碱菌已经从土壤、碱湖、碱性泉甚至海洋中分离得到.由于大部分碱湖伴有高盐,许多嗜碱菌同时也是嗜盐菌.该类菌所产生的酶如耐碱蛋白酶和碱性纤维素酶可作为洗涤剂的舔加成分,也可将碱性淀粉酶用于纺织品工业.嗜碱菌中的基因还可以用来调节其他细菌中基因产物的表达和分泌.嗜热微生物是嗜热菌最好的来源.有人从温泉和海底火山口分离出了极端嗜热菌.从意大利境内的喷硫磺气的火山口中分离到一种原始的微生物,在pH2和90℃时生长最好,其代谢类型极不寻常,既能作为耗氧型自养菌将硫氧化成硫酸,使自己增殖,又能作为厌氧菌用氢还原硫,生成H2S. l=8)\x1b_z;~D
第二节 含微生物样品的富集培养 $#2\x05ik~\x0e]>
富集（enrichment）培养是在目的微生物含量较少时,根据微生物的生理特点,设计一种选择性培养基,创造有利的生长条件,使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖,数量增加,由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种,以利分离到所需要的菌株. v_)a=I%o&2
富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制.一般可从以下几个方面来进行富集. ;Z\x1dHK\x13TOoK
一、控制培养基的营养成分 )67_\x1a\x11\x1eyHW
微生物的代谢类型十分丰富,其分布状态随环境条件的不同而异.如果环境中含有较多某种物质,则其中能分解利用该物质的微生物也较多.因此,在分离该类菌株之前,可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源.那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖,其他微生物则由于不能分解这些物质,生长受到抑制.当然,能在该种培养基上生长的微生物并非单一菌株,而是营养类型相同的微生物群.富集培养基的选择性只是相对的,它只是微生物分离中的一个步骤. sDT\x19(3{)L7
现举两例,如要分离水解酶产生菌,可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源,加入含菌样品,给目的微生物以最佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培养.能分解利用该底物的菌类得以繁殖,而其他微生物则因得不到碳源无法生长,菌数逐渐减少.此时分离将得到所需的微生物.又如要分离耐高渗酵母菌,由于该类菌在一般样品中含量很少,富集培养基和培养条件必须严密设计.首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去取样.富集培养基为5%～6%的麦牙汁,30%～40%葡萄糖,pH3～4,在20～25℃温度下进行培养,可以达到富集的目的. , mE\x0eFp_a+
在富集培养时,还需根据微生物的不同种类选用相应的富集培养基,如淀粉琼脂培养基通常用于丝状真菌的增殖,配方为（%）：可溶性淀粉4,酵母浸膏0.5,琼脂2,pH6.5～7.0.在配制时要特别注意酵母浸膏加量,过多会刺激菌丝生长,而不利于孢子的产生. Y:[W\x1fwX\x08|
根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点,可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌.如以苯胺作惟一碳源对样品进行富集培养,待底物完全降解后,再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养液中,如此连续移接培养数次.同时将苯胺浓度逐步提高,便可得到降解苯胺占优势的菌株培养液,采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离,即可得到能降解高浓度苯胺的微生物.移种的时间既可根据底物的降解情况,也可通过微生物的生长情况确定.如在分离环己烷降解菌时,样品经环己烷为惟一碳源的培养基富集后,培养液由原来的无色变为浑浊的乳白色.同时锥行瓶壁上也可观察到微生物的生长情况.此时可以2%的接种量移入新鲜的富集培养基中继续培养.连续富集培养的方法虽耗时较长,有时甚至需要6～7个月,但效果较好.通过该方法分离DDT、甲基对硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌,也都取得了满意的结果. W6\x07ZXb_\x14\x1cX
二、控制培养条件 OSk:njyC\x18[
在筛选某些微生物时,除通过培养基营养成分的选择外,还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养,达到有效的分离目的.如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5）,霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）.因此,富集培养基的pH值调节到被分离微生物的要求范围不仅有利于自身生长,也可排除一部分不需要的菌类. P1;T-\x1d.X~&
分离放线菌时,可将样品液在40℃恒温预处理20分钟,有利于孢子的萌发,可以较大的增加放线菌数目,达到富集的目的. \x07,c\x1aPNZ-\x06%
筛选极端微生物时,需针对其特殊的生理特性,设计适宜的培养条件,达到富集的目的. 3p{N7/z\x14(\x1f
一般所筛选的微生物通常是好氧菌,但有时也需分离厌氧菌.因严格厌氧菌不仅可省略通气、搅拌装置,还可节省能耗.这时除了配置特殊的培养基外,还需准备特殊的培养装置,创造一个有利于厌氧菌的生长环境,使其数量增加,易于分离. WJ=D\x10TO\x1fN\x01
三、抑制不需要的菌类 vA@K\x1fb3 \x12,
在分离筛选的过程中,除了通过控制营养和培养条件,增加富集微生物的数量以有利于分离外,还可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量,使目的微生物的比例增加,同样能够达到富集的目的. K\x14dh(v\x14NB>
从土壤中分离芽孢杆菌时,由于芽孢具有耐高温特性,100℃很难杀死,要在121℃才能彻底死亡.可先将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h,杀死不产芽孢的菌种后再进行分离.在富集培养基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长,对革兰阴性无抑制作.分离厌氧菌时,可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂,它能使培养基氧化还原电势下降,造成缺氧环境,有利于厌氧菌的生长繁殖. 9+"D8 \x15J7
筛选霉菌时,可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌,使霉菌在样品的比例提高,从中便于分离到所需的菌株；分离放线菌时,在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各30～50U/ml,以及丙酸钠10μg/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长.另外据报道,重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用,也可用于选择分离放线菌.在分离除链霉菌以外的放线菌时,先将土样在空气中干燥,再加热到100℃保温1h,可减少细菌和链霉菌的数量.分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时,可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间,杀死非目的微生物后再进行分离. LO]D XW \x0e9
对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时,采用富集培养以提高分离工作效率是十分必要的.但是如果按通常分离方法,在培养基平板上能出现足够数量的目的微生物,则不必进行富集培养,直接分离、纯化即可. 3{RuR+\x08yi\x1a
第三节 微生物的分离 \x18}uo5\x15rB5D
经富集培养以后的样品,目的微生物得到增殖,占了优势,其他种类的微生物在数量上相对减少,但并未死亡.富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起,即使占了优势的一类微生物中,也并非纯种.例如同样一群以油脂为碳源的脂肪酶产生菌,有的是细菌,有的是霉菌,有的是芽孢杆菌,有的不产芽孢,有的生产能力强,有的生产能力弱等等.因此,经过富集培养后的样品,也需要进一步通过分离纯化,把最需要的菌株直接从样品中分离出来. Mm`jk%:%\x08]