用双脱氧法怎样测出DNA的一级结构

是现在应用最多的核酸测序技术,由Sanger等1977年提出.
其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时,如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基,只要双脱氧碱基掺入链端,该链就停止延长,链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长.如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端,以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段.反应终止后,分四个泳道进行电泳.以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基),根据片段3’端的双脱氧碱基,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序.
(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的.
1.分离待测核酸模板,模板可以是DNA,也可以是RNA,可以是双链,也可以是单链.
2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP,例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板,则用反转录酶）,再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸).
3.与单链模板（如以双链作模板,要作变性处理)结合的引物,在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应,32P随着引物延长掺入到新合成链中.当ddNTP掺入时,由于它在3’位置没有羟基,故不与下一个dNTP结合,从而使链延伸终止.ddNTP在不同位置掺入,因而产生一系列不同长度的新的DNA链.
4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物,由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP),则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处.所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基.
5.放射自显影.根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列.
(二) 双脱氧测序的示剂及具体操作步骤（以双链DNA测序为例）.
1.变性双链模板的制备
(1) 材料 Tris/葡萄糖缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,10mmo1/L EDTA,50mmo1/L 葡萄糖),1％ SDS,0.2mo1/L NaOH,异丙醇,TE缓冲液pH8.0,4mol/L LiCl,冰冷 70％和无水乙醇,2mol/L NaOH,2mmol/L EDTA.
(2) 配制方法
① 取1.5ml处于对数生产期的培养菌液(含有待测病毒核酸的重组质粒模板),离心除去上清液后,用150?l Tris/葡萄糖缓冲液 重悬菌团,在室温下放置5分钟.
② 加入300?l的1％SDS,0.2mol/L NaOH,颠倒混合约15次,在室温下放置15分钟,加入225ml 3mol/L醋酸钠(pH4.5),颠倒约15次混合,在冰浴中放置45分钟,然后离心5分钟.
③ 将650?l上清液转移至一支新管中,加入650?l异丙醇,混合后在室温下放置10分钟,离心5分钟后弃去异丙醇,抽真空干燥沉淀.
④ 用125?l TE(pH 8.0)重新溶解DNA,加入375?l的4mol/L LiCl,在冰浴中放置20分钟后,于4℃下离心5分钟.
⑤ 将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提,加入2倍体积的异丙醇,在室温下沉淀30分钟,离心5分钟,弃去上清液.
⑥ 用冰冷的70％乙醇洗沉淀,离心5分钟,弃去上清液并干燥,用50?l TE缓冲液重新溶解沉淀.用紫外分光光度计测定质粒DNA含量.
⑦ 取0.2?g质粒DNA,并将体积调至9?l,加入1?l 2mol/L NaOH,2mmol/L EDTA,在室温下放置5分钟,加入2?l 30mol/L醋酸钠(pH 4.5)和8?l水.
⑧ 加入6?l冰冷无水乙醇,混合后在干冰／乙醇浴中放置15分钟,在4℃下离心5分钟,小心地弃去上清液,用冰冷的70％乙醇洗沉淀,离心5分钟并小心地弃去上清液,真空抽干沉淀,并用TE缓冲液重新溶解沉淀.
2.延伸和终止反应 以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例.
(1) 材料 变性的双链DNA模板(溶解在TE缓冲液中),0.5pmol/?L寡核苷酸引物(溶解在TE中,-20℃贮存),5×测序缓冲液(200mmol/L Tris pH7.5,50mmol/L MgCl2,-20℃贮存),0.1mol/l DTT(当月新配-20℃贮存),15pmol/L的3种dNTP混合物(缺dATP),1 000至1 500Ci/mmol ?32p dATP(在－20℃下达4至6周),修饰的T7 DNA聚合酶,标准酶稀释溶液(20mmol/L Tris－HCl pH7.5,0.5mg/mlBSA,10mmol/L ?- 巯基乙醇,4℃贮存),终止混合物(表2-30),甲酰胺上样缓冲液(0.2ml 0.5mol/LEDTA pH8.0,10mg溴酚蓝,10mg二甲苯青,10ml甲酰胺).
表2-30 T7DNA聚合酶终止反应混合物
反应成分 ddG ddA ddT ddC 最终浓度
H2O 15 15 15 15 －
5×测序缓冲液 6 6 6 6 － 1mmol/L
4dNTP 6 6 6 6 200μmol/L
1mmol/L ddGTP 3 － － － 20μmol/L
1mmol/L ddATP － 3 － － 20μmol/L
1mmol/L ddTTP － － 3 － 20μmol/L
1mmol/L ddCTP － － － 3 20μmol/L
(2) 配制方法
① 取4支0.5?l小离心管,标上G、A、T、C,每管加入7?l变性的双链DNA模板(分别为1和2?g),1?l寡核苷酸引物和2?l 5×测序缓冲液混合,65℃保温2分钟,在室温下冷却30分钟.
② 每管加入1?l 0.1mol/L DTT,2?l 1.5mol/L 3种dNTP混合物,0.5?l ?32P dATP和2?l(2IU)修饰的T7DNA多聚酶混合物,在室温下放置5分钟.
③ 按标记每管分别加入3?l 4种ddNTP终止混合物的一种.
④ 短促离心后,在37℃下保温5分钟.
⑤ 加入5ml甲酰胺上样缓冲液,上样前在80℃下加热2分钟,并迅速置于冰浴上,每个样品取3?l,上样电泳.
3.测序反应物电泳和序列读取
(1) 按普通聚丙烯酰胺凝胶制作方法制作梯度胶.
(2) 按G、A、T、C次序加入每种样品,在G、A和T各泳道上样1ml,而在C泳道上样1.5?l.
(3) 上样完毕加压1700V电泳,根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间.
(4) 电泳完毕,在10℃冰醋酸中漂洗30分钟脱去尿素.
(5) 在60℃或80℃干燥30分钟后,放射自显影读取序列.
人类基因组测序也是用的这个~~