制备单克隆抗体的过程

1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。
（1）体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
（2）体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。

（一）脾细胞 1．材料 (1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠.(2)1640培养液 单克隆抗*备流程
(3)2.5％FCS－1640营养液 2．操作方法 (1)拉颈或用CO2处死小白鼠.(2)将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾.(3)把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球.(4)用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中.(5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中.(6)以2.5％FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）.(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮.(8)重复⑹、⑺步骤.(9)计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80％为合格.（二）骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞.选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快,繁殖时间短.常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP2）；③P2—X­—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO以653最为常用,它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane,降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（MinerolOilplasmacytoma,MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系.骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可.由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理.为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml8－氮鸟嘌呤.取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞,在室温离心（400g）10min,沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数.（三）饲养细胞 在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞（Feedercell）.在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞.许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞.应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境.腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠.也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等.1．材料 （1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只.（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）.2．操作方法 （1）拉颈处死小鼠.（2）70％酒精浸泡消毒10min.（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔.（4）用注射器将4ml11.6％蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管.（5）1000r／min离心10min.（6）取上清,以HAT选择培养液将细胞制成悬液.台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞.（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml,含2万个细胞,放入CO2培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用.如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少,则可以在细胞换液时再加入一些.