苯酚硫酸法的条件试验苯酚硫酸法测多糖,标准曲线放硫酸后的冷却时间的条件试验,但做了很多次都没有好的结果,不知哪里出了问题,麻烦做过的人提供经验,有什么需要注意的地方,

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物.再以比色法测定.
[操作]
1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中,加水至刻度,分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却,室温放置20分钟以后于490nm测光密度,以2.0ml水按同样显色操作为空白,横坐标为多糖微克数,纵坐标为光密度值,得标准曲线.
2．样品含量测定：
①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨,再加少许5％TCA溶液研磨,倒上清液于10毫升离心管中,再加少许5％TCA溶液研磨,倒上清液,重复3次.最后一次将残渣一起到入离心管.注意：总的溶液不要超出10毫升.（既不要超出离心管的容量）.
②离心,转速3000转/分钟,共三次.第一次15分钟,取上清液.后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中.最后滤液保持18毫升左右.（测肝胰腺样品时,每次取上清液时应过滤.因为其脂肪含量大容易夹带残渣.）
③水浴,在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀,在96℃水浴锅中水浴2小时.
④定容取样.水浴后,用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀.定容至25毫升的容量瓶中.吸取0.2 ml的样品液,以蒸馏补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度.每次测定取双样对照.以标准曲线计算多糖含量.
[注意]
测定时根据光密度值确定取样的量.光密度值最好在0.1——0.3之间.比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克,仍取0.2ml样品液,如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定.