我在做overlap PCR,两个片段一条736bp,一条255bp,20个重叠碱基,四个引物的TM值都是59度,两条都P出来了
问题描述：
我在做overlap PCR,两个片段一条736bp,一条255bp,20个重叠碱基,四个引物的TM值都是59度,两条都P出来了
现在加入两端的引物,就是扩不出来1000的条带,这20重叠有13个是CG对,我不知道是不是退火温度的原因,54°了都,总之就是两条链不连,
答
试试把退火时间延长一些,看能不能把两条链连上.一般就是照着引物的Tm值做就可以的.退火时间是30S，应该足够了，对于退火温度能给个建议吗？我现在不加两端引物，先做Pool，看看能不能连，谢谢你的建议！退火时间确实不是一个很关键的因素。你两条链的量怎么样？PCR的时候最好两条模板链的加入量差不多，这样容易连上。退火温度，我也试着往下降过，不过没有用，最后也不知道怎么就做出来了。。。。。。两条链含量相近，55°退火30s，25个循环，现在Pool做出来了，不是很亮，加两端引物扩增后就很亮了，谢谢你的帮助！