细菌鞭毛染色制片有哪些注意事项

1.镀银法染色
（1）清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片,最好选用新的.为了避免玻片相互重叠,应将玻片插在专用金属架上,然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤,以除去粗颗粒）,煮沸20min.取出稍冷后用自来水冲洗、晾干,再放入浓洗液中浸泡5—6天,使用前取出玻片,用自来水冲去残酸,再用蒸馏水洗.将水沥干后,放入95%乙醇中脱水.
（2）菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛,所以在染色前应将待染细菌在新配制的半固体牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润,斜面基部含有冷凝水）.用消过毒的盖玻片切取培养基边缘的小块琼脂放进试管中,注意要轻放并轻轻摇动,将该试管放在37℃恒温箱中静置10min（放置时间不宜太长,否则鞭毛会脱落）,让幼龄菌的鞭毛松展开.然后,吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端,立即将玻片倾斜,使菌液缓慢地流向另一端,用吸水纸吸去多余的菌液.涂片放空气中自然干燥.要注意的是菌液的含菌数量一定要少!
干燥后的处理
(1) 干燥后用稀盐酸或稀氢氧化钠滴,并立即倾斜玻片,使酸(碱)液流下,并自然干燥.
(2) 用冲稀的头发顶型剂滴加,处理一到三分钟(具体的要实验才能知道),并自然干燥.
用于鞭毛染色的菌体是用半固体培养基才用支点法培养的.方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中,在培养皿中间放三块成分减半（但是NaCl不减半,琼脂为正常百分比）的,恒温培养12-24h后,取扩散菌落的边缘制作涂片.
（3）染色
①滴加A液,染4—6min.
②用蒸馏水充分洗净A液.
③用B液冲去残水,再加B液于玻片上,在酒精灯火焰上加热至冒气,约维持0.5—1min（加热时应随时补充蒸发掉的染料,不可使玻片出现干涸区）.
④用蒸馏水洗,自然干燥.
（4）镜检：先低倍,再高倍,最后用油镜检查.
结果：菌体呈深褐色,鞭毛呈浅褐色.
下面就如何做好鞭毛染色谈几点意见供参考.
1．要选好菌种.一般用周生鞭毛菌（如普通变形杆菌Proteus vulgaris）较好,这类菌的鞭毛多而长易于观察.
2．要注意培养条件和培养时间：①用点接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固体平板上接种.一般一个平板点接3～4处.经比较用半固体培养基培养出来的菌体活动度大,鞭毛长且多,易于染色,这可能与半固体培养基更适于菌体运动、鞭毛生长较好有关.用点接种法在平板上接种更易于挑取边缘幼龄的菌体.②培养时间要严格掌握,一般培养9～12h较好,菌龄超过15h,鞭毛染色效果较差,这可能与老龄菌体活动度降低、鞭毛易脱落有关.冰箱长期保存的菌种不宜直接用于鞭毛染色,需用新制备的斜面连续转接2～3次后再染色.
3．所用玻片的准备：①用过的旧载片要选择光滑无划痕的,放入已加入洗衣粉的蒸馏水中煮沸（如能预先过滤去渣更好）,煮毕冷却后,清水洗净,放入浓洗液中浸泡24h,取出用清水冲洗残酸,最后用蒸馏水洗净,沥干水并放于95％乙醇中脱水,取出后烧去酒精,即可使用.②新的载片虽没有油污、划痕,但含游离碱较多,所以要用2％盐酸浸泡几小时,用自来水冲洗干净,然后再用蒸馏水洗净,沥干后再用效果较好.
4．染色液一定要新鲜,特别是硝酸银染色法中更是如此,A染液和B染液最好都现用现配,A液一般不能放置.
5．染色过程中的细节也应充分注意：①取菌要取菌落边缘的幼龄菌体.②取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可,不要用力太猛,更不能用接种环大幅度涂开；将载片稍倾斜,使菌液散开即可,否则鞭毛易脱落,造成染色失败.③鞭毛染色的玻片只能自然干燥,不能用热风吹干,不能热固定,这是由于加热后菌体易变形,鞭毛易脱落,影响观察.④A染液染3～5min,其后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时一定要充分,否则加B染液后,背景很脏,鞭毛不易被观察到,影响实验效果.⑤加B染液后,将玻片稍加热（但不能太热,更不能沸腾或蒸干）使其微冒蒸汽,30～60s,染色效果较不加热为好.⑥B染液染完后,用蒸馏水冲洗比用自来水冲洗效果好.
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