下列有关平板划线接种法的操作错误的是（　　）A. 将接种环放在火焰上灼烧B. 将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环液C. 蘸取菌液和划线要在火焰旁进行D. 划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连

A、将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他的金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，故A正确；
B、接种环必须冷却后，才可以伸入菌液中蘸取一环液，否则会烧伤或烧死微生物，故B正确；
C、蘸取菌液和划线要在火焰旁进行，防止空气中的杂菌，故C正确；
D、划线时要避免最后一区的划线与第一区线连． 因为最后一区是细菌最稀少的，而第一区是细菌最致密的，如果连在一起则有可能影响单个菌落的分离效果，故D错误．
故选：D．
答案解析：本题考查平板划线操作方法．在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在火焰上灼烧，接种时划线操作是在火焰边进行．
考试点：微生物的分离和培养．
知识点：本题考查了微生物的平板划线操作的相关内容，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力．