如何制备大肠杆菌感受态细胞

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
准备：
　　一.材料
　　E.coli DH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA:购买或实验室自制,eppendorf管.
　　二.设备
　　恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪.
　　三.试剂
　　1.LB固体和液体培养基
　　2.Amp母液
　　3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板.
　　4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板.
　　5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌.
　　6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌.
操作步骤：
　　一、 受体菌的培养
　　从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期.将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右.
　　二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
　　1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟.
　　2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟.
　　3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液.
　　4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年.
　　三、 转化
　　1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上.
　　2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后.
　　3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟.
　　4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ).
　　5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时.
　　同时做两个对照:
　　对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同.此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现.
　　对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落.
　　四、 计算转化率
　　统计每个培养皿中的菌落数.
　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下：
　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
　　感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
　　[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化.但它们的转化效率并不一定一样.有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率.